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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/4767

Title: Regulation of GABA transporter GAT-1 in neuronal cells : role of brain-derived neurotrophic factor and adenosine
Authors: Vaz, Sandra Cristina Henriques, 1978-
Advisor: Sebastião, Ana Maria Ferreira de Sousa, 1958-
Keywords: Teses de doutoramento - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: Gamma-aminobutyric acid (GABA) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the central nervous system. Its activity at the synapse is terminated by re-uptake into nerve terminals and astrocytes, through membrane located specific GABA transporters (GATs), which therefore shape GABAergic transmission. There are three main high affinity subtypes of GATs, GAT-1, GAT-2 and GAT-3, and a low affinity one, the betaine transporter. GAT-1 is the predominant GABA transporter in the brain and is expressed in neurons and astrocytes. Several factors can regulate the continuous traffic of GATs to and from the neuronal plasma membrane. For instance surface expression of GAT-1 in cultured neurons and isolated nerve terminals is decreased by protein kinase C (PKC)-dependent phosphorylation. In contrast, surface expression of GAT-1 in neurons is enhanced by brain derived neurotrophic factor (BDNF)-mediated tyrosine kinase-dependent phosphorylation. Though reuptake of GABA might occur at different places of the neuronal membrane, its reuptake by the nerve terminal is the process that allows quick refilling of the released stores. On the other hand, uptake by astrocytes contributes to a fast removal of GABA from the synapse and delays its delivery to the neuronal release stores. To understand how GABAergic transmission can be shaped, it is therefore important to know how a single modulator can affect both processes of GABA removal from synapse. Thus, in the work presented on this thesis I evaluated the influence of BDNF upon GAT-1 transporters on presynaptic nerve terminals and cortical primary astrocyte culture. BDNF decreased GAT-1 mediated GABA uptake by isolated hippocampal rat nerve terminals (synaptosomes), an effect that occurred within 1 min of incubation with BDNF through activation of TrkB receptor. In contrast with what has been observed for other synaptic actions of BDNF, the inhibition of GABA transport by BDNF does not require tonic activation of adenosine A2A receptors, nevertheless is facilitated by activation of A2A receptors. On the other hand, BDNF enhances GAT-1 mediated GABA transport in cultured astrocytes, an effect mostly due to an increase in Vmax kinetic constant. This effect involves the truncated form of TrkB receptors (TrkB-t) coupled to a non-classic PLC-y/PKC-δ and Erk/MAP kinase pathway and requires active adenosine A2A receptors. To elucidate the trafficking of GAT-1 when astrocytes were treated with BDNF, a functional mutant of the rat GAT-1 was generated in which hemagglutinin epitope (HA) was incorporated into the second extracellular loop. By ELISA experiments, performed with astrocytes expressing HA-rGAT-1 transporter, it was possible to observe an exocytosis of HA-GAT-1 to plasma membrane when cells were treated with BDNF. In addition, cell surface biotinylation experiments, performed with astrocytes overexpressing the wild type rat GAT-1 (rGAT-1), also demonstrate an increase of GAT-1 2 transporter at plasma membrane when astrocytes were treated with BDNF. Results from experiments using selective inhibitors of endocytosis or selective inhibitors of recycling of molecules back to the plasma membrane allowed concluding that BDNF enhances GAT-1 expression at surface astrocytic membrane by slowing down exocytosis. A new role for BDNF is proposed whereby the effect of BDNF on GAT-1 transporter differs between pre-synaptic nerve terminals and astrocytes, suggesting that this neurotrophin operates in a much localized way, so that it may retard GABA uptake by the nerve terminal, enhancing synaptic actions of GABA, and accelerate its reuptake at extracellular neuronal areas allowing replenishment of neuronal pools of GABA. The results suggest that BDNF plays an active role in the regulation of GABAergic synaptic signalling, contributing to information processing.
O ácido y-aminobutírico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório do sistema nervoso central. A rápida remoção do GABA presente na fenda sináptica, por transportadores de alta afinidade para o GABA, que se localizam quer a nível do terminal pré-sináptico dos neurónios, quer a nível das células da glia, nomeadamenrte dos astrócitos (Gether et al., 2006), é essencial para uma sinalização eficaz mediada por este neurotransmissor. Até ao momento quatro transportadores foram identificados para o GABA, três destes de alta afinidade, denominados de GAT-1, GAT-2 and GAT-3 e um quarto, de baixa afinidade, denominado betaine transporter. O transportador GAT-1 é o transportador de GABA predominante no sistema nervoso central e encontra-se expresso preferencialmente em neurónios, sendo, no entanto, também expresso em astrócitos. Relativamente ao transportador GAT-3, sabe-se que este é maioritariamente expresso em astrócitos, onde tem um predomínio de transporte de GABA relativamente ao transportador GAT-1. Assim a recaptação de GABA pode ocorrer em diferentes localizações celulares. Quando ocorre para o terminal nervoso pre-sináptico, tem como consequência uma rápida reposição do nível de GABA nas vesículas sinápticas. A ocorrência para os astrócitos contribui para uma remoção mais rápida do GABA da fenda sináptica, diminuindo assim a velocidade de reposição de GABA nas vesículas sinápticas. Para se entender como é que a transmissão GABAérgica é regulada, torna-se pois extremamente relevante compreeender como pode apenas uma molécula modular os dois locais onde ocorre transporte de GABA, nomeadamente o pré-sináptico e o astrocítico. Salienta-se também a importância dos transportadores para o controlo da excitabilidade e o seu eventual envolvimento em situação patológica, nomeadamente em doentes com epilepsia do lobo temporal que apresentam uma aumento da expressão dos transportadores de GABA nos astrócitos. Os transportadores de GABA são regulados de diversos modos, estando envolvidos diferentes factores e várias cascatas de transdução de sinal. Esta modulação pode ocorrer de dois modos distintos: por alteração do Km ou da Vmax do transportador. A regulação do tráfego dos transportadores de GABA de, e para a membrana plasmática neuronal, pode ocorrer por variações da velocidade de endocitose e exocitose e/ou por alteração da quantidade de transportadores disponíveis neste processo de tráfego contínuo. Uma molécula já identificada como reguladora do transportador GAT-1 é o Brain derived neurotrophic factor (BDNF). O BDNF é um factor neurotrófico com importantes funções na diferenciação, maturação e sobrevivência neuronal, levando a modificações estruturais e moleculares a longo-prazo que são cruciais para o desenvolvimento, mas também para a função 2 e plasticidade sináptica no indivíduo adulto (Vicario-Abejon et al., 2002). O BDNF exerce a sua acção através da activação de receptores tirosina cinase B (TrkB), que se apresentam em diferentes isoformas: uma isoforma “completa” (TrkB-fl) que apresenta domínios tirosina cinase e uma isoforma truncada (TrkB-t) que não apresenta estes domínios. O BDNF favorece a recaptação de GABA devido a um aumento da expressão de GAT-1 a nível da membrana plasmática em culturas primárias de neurónios, não se sabendo até ao início deste trabalho qual a função do BDNF no controlo da actividade do GAT-1 local a nível de terminais nervosos. Os astrócitos são a maior classe de células da glia encontrada no cérebro dos mamíferos e têm um papel extremamente relevante na transmissão sináptica, contribuindo para o processamento de informação a nível sináptico ao controlar quer a composição do meio extracelular, quer a quantidade de neurotransmissores presentes na fenda sináptica. Os astrócitos são assim células fundamentais a nível da comunicação existente entre astrócitos ou entre astrócitos-neurónios. No que diz respeito à regulação dos níveis extracelulares de GABA, estas células têm um papel muito importante uma vez que expressam transportadores específicos de GABA, que permitem, como foi anteriormente referido, o controlo dos níveis deste neurotransmissor na fenda sináptica. Todavia, pouco tem sido descrito em relação à regulação dos transportadores de GABA nos astrócitos. O trabalho que aqui se apresenta teve como objectivo estudar o efeito do BDNF sobre o transportador de GABA, em terminais nervosos pré-sinápticos e em astrócitos, bem como estudar os mecanismos subjacentes ao efeito do BDNF. Foi também abordado o possível envolvimento dos receptores A2A da adenosina, uma vez que a interacção entre o receptor do BDNF, TrkB e o receptor de adenosina A2A, tem sido descrita em vários sistemas biológicos. Verificou-se que em terminais nervosos pré-sinápticos o BDNF tem uma acção inibitória sobre o transportador exclusivo de GABA (GAT-1) nesta estrutura, levando a uma diminuição da recaptação de GABA através deste transportador. Este efeito depende da concentração de BDNF e ocorre num intervalo de tempo extremamente curto (1 minuto). O efeito do BDNF no transportador GAT-1 ocorre através da activação do receptor TrkB e, contrariamente a outros efeitos mediados pela activação deste receptor, não requer a activação tónica dos receptores A2A da adenosina. Em culturas primárias de astrócitos o BDNF aumentou a recaptação de GABA mediada pelo transportador GAT-1, não tendo qualquer efeito no transportador GAT-3, também presente nos astrócitos. Este efeito ocorre devido a um aumento da velocidade máxima do transportador. O efeito do BDNF envolve a forma truncada do receptor TrkB, estando esta acoplada a uma via não clássica da PLC-y/PKC-δ e da Erk/MAP cinases. O efeito descrito requer que os receptores 3 A2A da adenosina estejam activos, sendo que os níveis endógenos de adenosina extracelular são suficientes para desencadear o efeito do BDNF. Uma vez que um aumento do Vmax se correlaciona com um aumento do número de transportadores na membrana plasmática, procedeu-se seguidamente à avaliação de um possível aumento da expressão do transportador GAT-1 quando as células eram tratadas com BDNF. Para avaliar se o efeito do BDNF se correlacionava com o tráfego de GAT-1 de, e para a membrana celular, foi gerado um mutante funcional do transportador GAT-1 de rato (rGAT-1), no qual foi introduzido o epítopo hemaglutinina (HA) no segundo loop extracelular do transportador, procedendo-se à infecção dos astrócitos com o referido mutante. Após o tratamento das células com BDNF observou-se um aumento da expressão de HA-rGAT-1 na membrana plasmática. Também através de experiências de biotinilação, realizadas com astrócitos que sobreexpressavam rGAT-1, se pôde concluir que o BDNF aumenta a expressão de rGAT-1 na membrana plasmática. Estudos onde se usou um inibidor da endocitose (dynasore) ou um inibidor da reciclagem de moléculas internalizadas de volta para a membrana plasmática (monensin), permitiram concluir que o efeito do BDNF envolve inibição da internalização de GAT-1 nos astrócitos, tendo esta acção consequências na expressão do GAT-1 e na velocidade de transporte de GABA. Os resultados apresentados nesta tese mostram que o BDNF exerce a sua acção de um modo muito localizado, levando a uma diminuição da recaptação de GABA no terminal nervoso que favorece eventualmente as suas acções sinápticas, e a uma aceleração da recaptação de GABA em regiões extra-sinápticas, que contribui para uma redução da acção tónica deste neurotransmissor. Em última instância, este efeito do BDNF deverá determinar uma diminuição da velocidade de reposição de GABA nas vesículas sinápticas, conduzindo desta forma a um aumento da excitabilidade neuronal.
Description: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/4767
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