Universidade de Lisboa Repositório da Universidade de Lisboa

Repositório da Universidade de Lisboa >
Faculdade de Ciências (FC) >
FC - Dissertações de Mestrado >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/5033

Title: Viral modulation of interferon (IFN) responses to african swine fever virus (ASFV)
Authors: Costa, Emanuel Nery de Oliveira Quartin, 1986-
Advisor: Parthouse, Michael
Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Keywords: Virologia
Peste suína africana
Biologia molecular
Citoquinas
Interferão
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: A imunidade inata constitui a primeira resposta dada por um hospedeiro quando atacado por agentes patogénicos. A resposta imune baseia-se em genes codificados na linha germinativa, chamados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Estes conseguem distinguir o “Eu” do “não-Eu”, reconhecendo padrões moleculares conservados ao longo da evolução dos vários agentes patogénicos, chamados padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs). No caso dos vírus, um parasita intracelular obrigatório, os PAMPs mais importantes e mais estudados são o seu material genético, tal como o DNA genómico viral, RNA de cadeia dupla (ds) ou simples (ss) ou a estrutura RNA viral, 5’- trisfosfato-RNA. Existem vários PRRs, que podem ser agrupados em classes: os receptores transmembranares do tipo Toll (TLRs), os receptores citoplasmáticos do tipo RIG-I (RLRs), os receptores do tipo Nod (NLRs) e os receptores do tipo AIM2 (ALRs). Os PRRs iniciam uma sinalização em cascata que culmina com a activação de factores de transcrição, que entre outros, vão induzir a produção e excreção duma citoquina, o interferão (IFN). Este grupo de citoquinas é composto por três classes, IFN tipo I (p.e IFN-α/β) , tipo II (p.e IFN-γ) ou do tipo III (p.e. IFN-λ). O IFN pode despoletar variados efeitos anti-virais. A cascata de sinalização estimulada pelo IFN inicia-se com a ligação do IFN ao seu respectivo receptor extra celular que ,através de fosforilações, permite a activação de receptores intracelulares. Já no interior da célula, sinalizadores de transdução e ativadores da transcrição (STATs) são recrutados e fosforilados, o que permite a formação de homo ou heterodímeros que migram para o núcleo. No núcleo, as STATs ligam-se a zonas promotoras de genes estimulados pelo IFN (ISGs), para promover a transcrição de mais de 300 ISGs com propriedades anti-virais. No caso do estímulo causado por IFN do tipo I, os complexos formados pelas STATs vão ligar-se ao elemento de resposta estimulado pelo IFN (ISRE). No caso do IFNs do tipo II, os complexos ligam-se à sequência activada pelo IFN-λ (GAS). Os ISGs facultam ao hospedeiro diversas estratégias para combater a infeção viral. Apesar de os mamíferos possuírem um sistema imune bastante evoluído, os vírus também têm evoluído estratégias para evitar e/ou manipular as defesas do hospedeiro, dedicando uma parte substancial do seu genoma a estas estratégias. Estas podem ir desde uma interferência global na expressão e/ou síntese de proteínas das células do hospedeiro, ou serem mais específicas, diminuindo o impacto dos IFNs. O estudo destas interações, pode não só ser útil para conhecer os mecanismos de infecção do vírus, mas também para perceber melhor os mecanismos de defesa do hospedeiro. Estes conhecimentos podem permitir o desenvolvimento de terapias e tratamentos anti-virais ou mesmo anticancerígenos. A peste suína africana (ASF) é uma doença que nos porcos domésticos (Sus sacrofa) é tipicamente hemorrágica e leva normalmente à morte do hospedeiro. Contudo, as infecções são assintomáticas nos hospedeiros naturais, o javali, o porco selvagem e a carraça, sendo esta última, um dos principais vectores de transmissão do vírus da peste suína africana (ASFV), tornando o seu controlo difícil sem uma vacina. Nos últimos anos, devido ao grande desenvolvimento urbano e consumo de carne de porco, têm havido surtos de ASF em África, causando perdas devastadoras. O ASFV é um virus de DNA de cadeia dupla, o único arbovírus de DNA e o único membro da familia Asfaviridae, infectando principalmente macrófagos e monócitos. Tal como todos os vírus, o ASFV contém genes que manipulam a biologia da célula do hospedeiro, como por exemplo, genes que inibem a apoptose e respostas imunes controladas pelo factor nuclear kappa B (NFκB), entre outros. Contudo, ainda não foi demonstrado que algum gene do ASFV consiga inibir a resposta do IFN. Isto é surpreendente, pois o ASFV infecta macrófagos, um tipo de célula sensível ao IFN e porque a sua infecção persistente, é incompatível com uma resposta efectiva mediada por IFN. O K205R é um gene do ASFV sem função definida, mas ensaios preliminares de luciferase mostraram que este gene consegue inibir a resposta do IFN. Contudo, os mecanismos utilizados pelo K205R nesta inibição são desconhecidos. O objectivo desta dissertação de mestrado é tentar perceber melhor estes mecanismos e determinar a sequência mínima necessária para que o K205R tenha o efeito observado. O K205R foi isolado através de PCR, utilizando como molde o DNA genómico da estirpe do AFSV, BA71. Subsequentemente, foiclonado no plasmídeo pcDNA3, que contém um marcador molecular, a hemaglutinina (HA), a montante da zona de inserção do gene. Para determinar a extensão da ação do K205R, foram feitos ensaios de luciferase utilizando células transfectadas com repórteres de luciferase sobre o controlo dos promotores de IFN- β, ISRE e GAS. O K205R mostrou inibição para todos os reporteres. Para tentar definir a zona do K205R responsável pelo efeito observado, fez-se uma previsão da estrutura secundária da proteína do K205R, recorrendo à bioinformática, que permitiu identificar uma sequência “coiled-coil” putativa, uma estrutura secundária associada a interações entre proteínas. Também é sugerida uma sequência putativa para um sinal de exportação nuclear (NES). Com base nesta análise foram construídos quatro fragmentos do K205R e posteriormente clonados no pcDNA3. Depois de se verificar a sequencia correcta de DNA de cada um dos clones e expressão das suas proteinas em células vero transfectadas , o passo seguinte foi verificar a localização celular destes fragmentos através de imunofluorescência nestas mesmas células. Esta experiência permitiu verificar que de facto, os fragmentos que não tinham a sequência putativa NES, em comparação com células transfectadas com o K205R inteiro, tinham uma maior acumulação nuclear. Para estudar o mecanismo, e a que nivel o K205R actua para inibir a via de sinalização do ISRE, foi feito um “western blot” utilizando extractos proteicos de células VERO transfectadas com os diferentes fragmentos do K205R e posteriormente estimuladas com IFN-β durante 15 minutos e durante 45 minutos. Esta experiência permitiu verificar que a fosforilação da STAT1 diminui na presença do K205R, contudo, apenas um fragmento reproduziu este efeito. Este fragmento de 75 aminoácidos não contém a sequência, nem para a sequência “coiled-coil”, nem para NES. Esta dissertação de mestrado apresenta resultados consistentes com a existência de um NES funcional na sequência do K205R, uma inibição da fosforilação da STAT1 mediada pelo K205R, mas também apresenta uma abordagem para determinar os mecanismos utilizados pelo K205R para inibir a indução e o impacto do IFN-β. Contudo, mais experiências têm de ser feitas para realmente se comprovar a existência de um NES, como por exemplo, ensaios de imunofluorescência de células transfectadas com K205R na presença de Leptomicina B, um inibidor da exportação nuclear. Também será necessário estudar as vias de sinalização inibidas pelo K205R que não foram abordadas neste trabalho, tal como a via de indução de IFN-β e a via do GAS.
A key part of the innate response to virus infections is the interferon (IFN) response. This can limit virus replication and dissemination and is a critical factor in controlling virus infections, particularly persistent viruses. Many viruses encode proteins which interfere with induction of IFN and IFN-activated pathways and these can have important roles in virus pathogenesis and persistence. African Swine Fever (ASF) causes major economic losses in many African countries and is a threat to pig farming worldwide. There is no vaccine and therefore options for disease control are limited. In Europe, there is always the danger of accidental introduction of the virus, as indeed occurred in Portugal in 1957, causing severe financial losses. Thus, defining the mechanism of proteins involved in evasion of the host’s defense response and in virus virulence is of extreme interest, so we can understand the virus and try to develop strategies to reduce ASF impact. ASFV is a large cytoplasmic DNA virus which encodes between 160 to 175 open reading frames. Many of its genes are not essential for replication in vitro, but are host evasion strategies facilitating virus replication and transmission in vivo. These include proteins which inhibit host defence systems. Surprisingly, since ASFV can survive as a persistent virus, no ASFV proteins have been described which inhibit the IFN response. However, the early gene K205R, might have an impact on IFN response. Luciferase assays, shown inhibitions of IFN induction (IFN-β) and IFN-signalling (ISRE, GAS) pathways. Using a bioinformatics tool (Jpred), we got a predication of K205R protein secondary structure. Based on this prediction, deletion mutant fragments of K205R were constructed and used in immunofluorescence and western blot assays. The immunofluorescence results suggest the presence of a functional nuclear export signal (NES) motif in the K205R protein sequence. Western blot experiments suggested that K205R is affecting the phosphorylation status of STAT1, in cells stimulated with IFN-β (ISRE pathway). Although it was not possible to clearly determine the minimum sequence needed for all the functions of K205R, the results suggest that K205R inhibition of the impact of IFN type I, depends on a sequence within amino acids 130 and 205, which affects STAT1 phosphorylation. Further experiments should be done to investigate the mechanism of K205R inhibition in the pathways not covered on this thesis (IFN-β induction pathway and GAS pathway). The existence of functional NES also needs confirmation.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/5033
Appears in Collections:FC - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:

File Description SizeFormat
ulfc092714_tm_emanuel_costa.pdf1.51 MBAdobe PDFView/Open
Statistics
FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpaceOrkut
Formato BibTex mendeley Endnote Logotipo do DeGóis 

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

 

  © Universidade de Lisboa / SIBUL
Alameda da Universidade | Cidade Universitária | 1649-004 Lisboa | Portugal
Tel. +351 217967624 | Fax +351 217933624 | repositorio@reitoria.ul.pt - Feedback - Statistics
DeGóis
  Estamos no RCAAP Governo Português separator Ministério da Educação e Ciência   Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Financiado por:

POS_C UE