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Título: Mecanismos moleculares da actividade anti-inflamatória de flavonóides: captação de HOCI e efeito na activação do factor de transcrição NF-kB
Autor: Cavaco, Patrícia A. Mestre
Orientador: Mira, Maria de Lurdes, 1949-
Palavras-chave: Inflamação
Flavonóides
HOCI
Neutrófilos
Células THP-1
NF-kB
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Resumo: O ácido hipocloroso (HOCl) é um oxidante forte produzido por neutrófilos e monócitos activados. Esta espécie reactiva de oxigénio (ROS) é gerada a partir da reacção do H2O2 com o Cl‒, catalisada pelo mieloperoxidase (MPO). Embora a formação de HOCl tenha como finalidade matar os microrganismos invasores dentro do fagossoma, pode ser libertado para fora da célula e levar à lesao dos tecidos, contribuindo para o processo inflamatório. O principal objectivo deste trabalho foi estudar as propriedades anti-inflamatórias de alguns flavonóides (quercetina, morina, apigenina e catequina), em relação à captação de HOCl, gerado por neutrófilos activados ex vivo, bem como os seus efeitos na activação do factor de transcrição NF-κB. Em relação à captação de HOCl, para cada flavonóide obtiveram-se diferentes valores de IC50, determinados através de diferentes métodos de competição: cloração da taurina e oxidação da sonda 3-aminofenilfluoresceína (APF), que foi seguida por espectrofluorimetria e citometria de fluxo. A quercetina e a morina apresentaram uma elevada actividade antioxidante com valores de IC50 semelhantes, uma vez que são compostos análogos e possuem as características estruturais que são determinantes para proteger as reacções de cloração/oxidação mediadas pelo HOCl. A apigenina, apesar de não possuir algumas dessas características estruturais, demonstrou possuir uma elevada capacidade antioxidante, devido à maior hidrofobicidade deste composto, quando comparado com a quercetina e a morina. Estudou-se, também, a capacidade dos flavonóides para induzir alterações na activação do NF-κB em células THP-1 activadas por LPS, usando duas abordagens diferentes. Quando as células foram transfectadas com um plasmídeo acoplado ao gene repórter da luciferase, que continha uma sequência kB de elevada afinidade para o NF-kB, e após activação com LPS, observou-se uma elevada activação do promotor do NF-kB. Na presença de alguns flavonóides (morina, apigenina, catequina e isorramnetina) observou-se uma diminuição na activação do promotor do NF-kB. Através da análise dos extractos celulares, por Western blot, também, se observou que a quercetina e a morina inibiam a activação do NF-kB. Esta resposta foi reflectida em termos da translocação do NF-κB para o núcleo e na inibição da degradação da proteína inibitória do NF-κB (IκB). Estes resultados sugerem que os flavonóides estudados podem exercer efeitos antiinflamatórios, através da captação de HOCl e, alguns deles, através da inibição do NF-kB.
Hypochlorous acid (HOCl) is a powerful oxidant produced by stimulated neutrophils and monocytes. This reactive oxygen specie is generated by the reaction of H2O2 with Cl−, catalyzed by myeloperoxidase, and has long been recognized to play an important role in the inflammatory process. Although this toxic species is generated with the aim of killing the invading microorganisms inside the phagosome, it can also be released to the outside of the cell, where it may damage normal tissue and thus contribute to the pathogenesis of inflammatory diseases. The main goal of this work was to study anti-inflammatory properties of some flavonoids (quercetin, morine, apigenin, catechin and ishoramnetin) towards the scavenging of HOCl generated by ex vivo activated human neutrophils as well as their effects on the activation of the transcription factor NF-κB. For each flavonoid, different IC50 values were obtained, when the scavenging of HOCl was assessed through different competition methods: taurine chlorination and oxidation of the probe 3-aminophenilfluorescein (APF), which was followed by spectrofluorimetry and flow cytometry. Quercetin and morine showed high antioxidant activity with similar IC50 values, since they are analogs and possess those structural features that are determinant for the protection against HOCl mediated chlorination/oxidation reactions. Apigenin, in spite of not possessing some of these structural features, also showed high antioxidant activity, due to the higher hydrophobicity of this compound, when compared to quercetin and morine. The ability of flavonoids to induce changes in the activation of NF-κB in THP-1 cells activated by LPS was also examined using two different approaches. When cells were transfected with a plasmid coupled to a luciferase reporter gene containing a kB sequence with high affinity for NF-kB and stimulated by LPS, high activation on NF-kB promoter was achieved. In the presence of some flavonoids (morin, apigenin catechin and ishoramnetin) a decrease on activation of NF-kB promoter was observed. Inhibitory effects in the activation of NF-κB, in cellular extracts analysed by Western blotting, were also observed for quercetin and morin. This response was reflected in terms of nuclear translocation of NF-κB and degradation of NF-κB inhibitory protein IκB. These results suggest that the studied flavonoids may exert anti-inflammatory effects through the scavenging of HOCl and some of them through the inhibition of NF-κB activation.
Descrição: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/5341
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