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Título: Caracterização biofísica da membrana plasmática da levedura
Autor: Branco, Francisco Maria dos Santos e Silva Aresta
Orientador: Almeida, Rodrigo Freire Martins de
Marinho, Helena Susana Pappámikail da Costa, 1958-
Palavras-chave: Jangadas lipídicas
Ácido trans-parinárico
Espectroscopia de fluorescência resolvida no tempo
Metabolismo de ergosterol e esfingolípidos
Fase gel rica em esfingolípidos
Teses de mestrado - 2009
Issue Date: 2009
Resumo: A membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae foi estudada por espectroscopia de fluorescência, utilizando as sondas de membrana ácido transparinárico e difenil-hexatrieno, de modo a compreender os princípios biofisicos subjacentes à formação e função de compartimentos membranares, cuja importância foi reconhecida recentemente. O estudo foi realizado em (i) células wt; (ii) esferoblastos (celulas wt com remoção completa da parede celular); (iii) lipossomas preparados a partir de extractos lipídicos totais de células wt; (iv) células erg6, que acumulam zimosterol em vez de ergosterol; (v) células scs7, que não sintetizam esfingolípidos com ácidos gordos C26:0 -hidroxilados. As principais observações foram: (a) a membrana plasmática da levedura possui domínios de gel ricos em esfingolípidos com conteúdo baixo ou nulo de esteróis; (b) os lípidos de levedura possuem a capacidade de formar domínios mais rígidos na ausência de proteínas do que os detectados na membrana plasmática; (c) os sistemas erg6e esferoblastos possuem uma maior ordem global de membrana; (d) modificações na biossíntese do ergosterol e a remoção da parede celular não alteram significativamente a rigidez dos domínios ricos em esfingolípidos, mas em ambos os casos há uma diminuição da sua abundância relativa. Os resultados obtidos sugerem que a parede celular desempenha um papel na estabilização dos domínios ricos em esfingolípidos que poderá ocorrer por interacção da mesma com proteínas ancoradas a glucosilfosfatidilinositol. A partir dos resultados também foi proposto um modelo em que nas células onde os domínios ricos em esfingolípidos sao menos abundantes ocorre uma distribuição mais homogénea de esfingolípidos por toda a membrana, responsável pelo aumento de ordem global da mesma. Concluindo, este trabalho comprova a existência de domínios ordenados tipo gel na membrana plasmática de organismos vivos, reforçando a ideia de que os esfingolípidos são componentes essenciais na constituição da membrana e na resposta a alterações fisiológicas que ponham em causa a integridade da célula.
The plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae was studied by fluorescence spectroscopy with the membrane probes trans-parinaric acid and diphenylhexatriene to understand biophysical principles underlying the formation and role of membrane compartments, with relevance recently recognized. The study included: (i) wt cells; (ii) spheroplasts (wt cells with complete cell wall removal); (iii) liposomes from total lipid extracts of wt cells; (iv) erg6Δ cells, which accumulate zymosterol instead of ergosterol; (v) scs7Δ cells, which lack synthesis of α- hydroxylated sphingolipid-associated C26:0 fatty acids. The main observations were: (a) the yeast plasma membrane contains sphingolipid-enriched gel domains with low or none sterol content; (b) yeast lipids have the ability to form, in the absence of proteins, domains more rigid than those detected in the plasma membrane; (c) erg6 cells and spheropasts have a higher membrane order; (d) alterations in sterol biosynthesis and cell wall removal do not significantly affect sphingolipid-enriched domains rigidity, although significantly reducing their relative abundance. The results obtained suggest that the cell wall has an important role in the stabilization of sphingolipid-enriched domains which might occur through its interaction with glucosylphosphatidylinositol anchored proteins. Furthermore, a model is proposed that explains the lower abundance of sphingolipid-enriched domains by a more homogeneous distribution of those lipids throughout the whole plasma membrane, thereby increasing the membrane global order. In conclusion, this work shows the existence of gel-like ordered domains in the plasma membrane of living cells, supporting the idea that sphingolipids are essential components for the constitution of biomembranes and for the response to physiological changes that are dangerous for the cell integrity.
Descrição: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009
URI: http://hdl.handle.net/10451/5476
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