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Título: Somatic expression of the testis-specific PDHA2 gene : mechanisms of activation/silencing
Autor: Pinheiro, Ana Sofia da Costa, 1981-
Orientador: Rivera, Isabel Maria Antolin Martins de Carvalho Croce, 1956-
Silva, Maria João M. S. Ferreira da, 1960-
Palavras-chave: Teses de doutoramento - 2012
Issue Date: 2012
Resumo: During spermatogenesis, germ cells undergo a complex process of cell differentiation and morphological restructuring, which depends on the coordinated expression of different genes. Some vital examples are those involved in cell energy metabolism, namely the genes encoding the E1α subunit of pyruvate dehydrogenase complex: the somatic PDHA1 (X-linked) and the testis-specific PDHA2 (autosomal). There are no data related to the study at the RNA and protein levels of PDHA genes during spermatogenesis. The present study aimed to describe the mRNA and protein expression patterns of the human PDHA genes during spermatogenesis. Expression profiles of the PDHA1 and PDHA2 genes were characterized using different human tissues and cells. Diploid and haploid germ cells fractions were obtained from testis tissues. The mRNA profiles were analyzed by qRT-PCR methods, whereas the protein profiles were evaluated by immunohistochemistry, western blotting and two-dimensional electrophoresis. Both PDHA proteins appeared localized to the cytoplasm. All somatic tissues showed similar levels of PDHA protein. Testis tissue, comprising somatic and germ cells, presented an increased protein level. PDHA2 was the sole protein species present in ejaculated spermatozoa. The developmental stage at which occurs the switch from PDHA1 to PDHA2 expression was determined by the study of mRNA expression levels during spermatogenesis, namely in diploid and haploid germ cells fractions, as well as in ejaculated spermatozoa. Expression of the PDHA1 gene was found in all somatic cells, whereas expression of PDHA2 gene was restricted to germ cells. The switch from the X-linked to the autosomic gene expression occurred in spermatocytes. Data suggests the activation of PDHA2 gene expression is most probably a mechanism to ensure the continued expression of the protein, thus allowing germ cell viability and functionality.
O Complexo do Piruvato Desidrogenase (cPDH) desempenha um papel central no metabolismo celular por estabelecer a ligação entre a glicólise e o ciclo dos ácidos tricarboxílicos, realizando a conversão de piruvato em acetil-CoA, fundamental para a obtenção de energia. As deficiências associadas a este complexo constituem uma das doenças genéticas mais comuns do metabolismo energético mitocondrial. O fenótipo clínico das deficiências do cPDH é caracterizado principalmente por grave hiperlactacidémia e neurodegenerescência crónica, sendo no entanto observado um largo espectro de características clínicas. Dada esta heterogeneidade, o fenótipo é normalmente classificado em três categorias distintas de acordo com a gravidade apresentada: neonatal, infantil e benigno. As terapias actualmente empregues visam estimular a actividade do complexo e melhorar o fenótipo clínico, e consistem, por exemplo, na implementação de uma dieta cetogénica, na suplementação com cofactores (tiamina, carnitina e ácido lipóico) e/ou na administração de dicloroacetato. Contudo, estas terapias revelam-se claramente insuficientes, pois raramente alteram a degenerescência neurológica associada à patologia, o que torna deste modo pertinente a procura de novas abordagens terapêuticas, nomeadamente ao nível genotípico. O cPDH é um sistema multienzimático constituído por múltiplas cópias de diferentes componentes: E1 (piruvato desidrogenase), um heterotetrâmero de duas subunidades α e duas β; E2 (di-hidrolipoíl-lisina acetiltransferase); E3 (di-hidrolipoíl desidrogenase); E3BP (proteína de ligação a E3); PDK (piruvato desidrogenase cinase) e PDP (piruvato desidrogenase fosfatase). Apesar deste complexo ser codificado por 13 genes diferentes, a maioria dos casos reportados de deficiência em cPDH resulta de mutações no gene PDHA1, que codifica a subunidade α do primeiro componente catalítico do complexo, E1. Esta subunidade apresenta-se sob duas isoformas distintas: uma codificada pelo gene PDHA1 e expressa em todos os tecidos somáticos; e uma segunda, codificada pelo gene PDHA2 e exclusivamente expressa nas células espermatogénicas. A existência desta segunda isoforma, e a sua potencial activação nos tecidos somáticos, foi apontada por alguns autores como a terapia ideal para os casos de deficiência em cPDH que resultam de mutações no gene PDHA1. No entanto, o conhecimento dos mecanismos de regulação da expressão do gene PDHA2 humano é extremamente diminuto e, Resumo xxiv consequentemente, o principal objectivo do presente trabalho consistiu em investigar os mecanismos que modulam a especificidade tecidular deste gene, nomeadamente a sua activação nas células espermatogénicas e a sua repressão nos tecidos somáticos. O primeiro capítulo da tese apresenta uma revisão geral da literatura sobre o cPDH, o gene PDHA2 e a regulação da transcrição génica, terminando com a descrição dos objectivos delineados para o presente trabalho. O trabalho iniciou-se com um interessante caso clínico que surgiu na nossa rotina laboratorial de diagnóstico (capítulo 2), o qual constituiu o ponto de partida para os estudos subsequentes. Neste capítulo reportamos o estudo de uma família, cuja análise molecular ao nível dos linfócitos revelou a presença simultânea de um transcrito PDHA1 incompleto e de um transcrito PDHA2 íntegro. Segundo o nosso conhecimento, esta é a primeira vez que a expressão do gene PDHA2 foi observada em células somáticas, o que representa uma oportunidade única para estudar os mecanismos de regulação deste gene. A análise deste caso permitiu-nos postular que a activação somática do gene PDHA2 se encontra, muito provavelmente, relacionada com mecanismos epigenéticos de regulação, nomeadamente com o estado de metilação do DNA. Antes de qualquer tentativa de elucidar os mecanismos envolvidos na regulação da expressão do gene PDHA2, revelou-se necessário obter algum conhecimento relativamente ao padrão de expressão deste gene em tecidos humanos, dada a ausência de dados na literatura. Desse modo, no capítulo subsequente (capítulo 3) descrevemos pela primeira vez o padrão de expressão dos genes PDHA1 e PDHA2, ao nível de expressão quer das proteínas quer dos transcritos, em diversos tecidos e células, e em particular durante a espermatogénese. Os resultados permitiram-nos confirmar a expressão somática do gene PDHA1, bem como a expressão exclusiva do gene PDHA2 em células espermatogénicas. Para além disso, a análise do padrão de expressão destes genes durante a espermatogénese levou-nos a concluir que a forma somática PDHA1 é substituída pelo forma testicular PDHA2 ao nível do espermatócito, antes da primeira divisão meiótica das células germinativas. Observámos também que, quer ao nível do homogeneizado testicular, quer ao nível do espermatozóide maduro, a proteína PDHA2 é a única isoforma encontrada, embora com uma massa molecular inferior à esperada, e concluímos que a activação do gene PDHA2 é uma maneira de assegurar a expressão da Resumo xxv subunidade E1α durante a espermatogénese e garantir a viabilidade e funcionalidade destas células germinativas. Numa primeira abordagem para compreender a regulação da expressão do gene PDHA2, e de acordo com o conhecimento sobre a metilação do DNA como um mecanismo importante na regulação da especificidade tecidular deste gene no murganho, começámos por avaliar os seus padrões de metilação e de transcrição em tecidos somáticos e testiculares humanos (capítulo 4). A análise da sequência do gene PDHA2 revelou a presença de duas ilhas CpG: uma no promotor próximo que se apresenta metilada em todos os tipos de tecidos estudados, e outra localizada na região codificante que se apresenta metilada nos tecidos somáticos e completamente desmetilada nas células espermatogénicas, onde o transcrito PDHA2 é normalmente expresso. É importante salientar que este padrão de metilação revelou uma correlação perfeita com a actividade transcricional, mas que neste caso particular é a desmetilação da ilha localizada na região codificante, e não no promotor do gene, que se correlaciona com a sua expressão. Nos estudos posteriores, pretendemos estudar os mecanismos de regulação e clarificar o papel da metilação na expressão do gene PDHA2 (capítulo 5). Começámos por clonar diferentes porções do promotor do gene PDHA2 e procedemos à análise das respectivas actividades transcricionais após transfecção em diversas linhas de células somáticas: SH-SY5Y (neuroblastoma humano), HeLa (adenocarcinoma cervical humano) e Ntera2/Clone D1 (teratocarcinoma humano). Os resultados revelaram que a transcrição dirigida pelo promotor ocorre nestas linhas celulares, as quais não expressam normalmente o gene PDHA2, e que esta actividade transcricional não apresentou diferenças óbvias entre as diversas linhas. Estes resultados sugerem que, após introdução transiente em células somáticas de plasmídeos contendo a região 5’ adjacente do gene PDHA2, o promotor não responde aos mecanismos de regulação que normalmente operam nestas células para inibir a expressão do gene in vivo. Para além disso, estes dados sugerem também que a expressão específica de tecido do gene PDHA2 não deverá envolver factores de transcrição específicos celulares, quer activadores ou repressores, mas possivelmente outro nível de modulação, como por exemplo mecanismos epigenéticos de regulação. Numa abordagem para avaliar o envolvimento de modificações epigenéticas na regulação da expressão deste gene, nomeadamente uma possível interacção entre a metilação do DNA e a acetilação das histonas, procedemos ao tratamento de uma linha Resumo xxvi celular somática (SH-SY5Y) com o fármaco hipometilante 5’-aza-2’-desoxicitidina (DAC) e com tricostatina A (TSA) que inibe as desacetilases de histonas. Os resultados da avaliação dos níveis de mRNA por qRT-PCR mostraram que o DAC induz a activação do gene PDHA2 em linhas celulares somáticas (SH-SY5Y), tendo-se observado, após estudos de imunoprecipitação da cromatina, o concomitante recrutamento da RNA polimerase II para o promotor próximo. Paralelamente, observouse que o DAC induz uma desmetilação relevante da ilha CpG localizada na região codificante, o que constitui assim a prova de que a metilação do DNA na região codificante desempenha uma função importante na regulação da expressão do gene PDHA2. Para terminar a presente tese, é apresentada no capítulo 6 uma discussão dos resultados obtidos, incluindo uma análise integrada de todo o trabalho e respectivas conclusões, bem como algumas perspectivas de trabalho futuro. Em suma, este trabalho contribuiu para o esclarecimento dos mecanismos de regulação da especificidade tecidular do gene PDHA2, demonstrando o envolvimento da metilação do DNA como mecanismo primário de regulação da expressão deste gene. Para além disso, demonstrou-se a possibilidade de activação do gene em células somáticas, o que constitui um avanço relevante na direcção de novas abordagens terapêuticas para as deficiências do cPDH causadas por mutações no gene PDHA1.
Descrição: Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/5504
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