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Título: Synthetic antibodies targeting HIV-1 infectivity
Autor: Couto, Andreia Domingos, 1976-
Orientador: Gonçalves, João, 1967-
Palavras-chave: Teses de doutoramento - 2012
Issue Date: 2011
Resumo: A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) representa hoje um dos principais problemas de Saúde Pública a nível mundial, tendo contraído a doença mais de 60 milhões de pessoas em todo o mundo desde a sua descoberta em 1981, um terço das quais faleceram subsequentemente. Apesar dos grandes progressos realizados no tratamento da SIDA, especialmente desde a introdução do regime terapêutico HAART em 1996, as alternativas terapêuticas actuamente disponíveis não permitem erradicar completamente o VIH-1 do organismo, o que resulta em toxicidade a longo prazo e leva eventualmente à emergência de estirpes de VIH-1 resistentes à terapêutica disponivel. Estes problemas levam à procura e desenvolvimento de novos fármacos activos contra o VIH, nomeadamente contra as estirpes de VIH resistentes aos fármacos actualmente utilizados. Entre os novos fármacos actualmente disponíveis encontra-se uma nova classe, os inibidores de entrada. O processo de fusão do VIH-1 é mediado pelas proteínas Env (gp120 e gp41) e inicia-se através da ligação da gp120 ao receptor celular CD4. A interacção gp120-CD4 dá origem a uma alteração conformacional na loop V3 da gp120 que expõe o epitopo de ligação ao receptor de quimiocinas, o que por sua vez induz alterações conformacionais na gp41 que culminam na conformação activa do péptido de fusão (conformação fusogénica). Portanto, a interação gp120-CD4 é fundamental para o processo de fusão vírus-célula. Igualmente, uma descoberta recente identificou na gp120 uma região conformacionalmente invariável que se sobrepõe parcialmente ao local de ligação ao CD4, esta região corresponde à zona de ligação do anticorpo b12 e possui a particularidade que se encontrar constitutivamente exposta no domínio exterior da gp120. Esta região encontra-se envolvida na ligação metaestável ao CD4, antes de ocorrer o rearanjo necessário para a existência de uma ligação estável. Este é por conseguinte um local de vulnerabilidade, relacionado com um requisito funcional para existência de uma associação eficiente com o CD4. iv O anticorpo b12 é um dos poucos anticorpos monoclonais humanos conhecidos que pode eficientemente neutralizar uma ampla gama de isolados primários de VIH-1 in vitro e pode proteger contra o desafio viral in vivo. O objetivo deste trabalho foi a avaliação da sequência alvo do anticorpo neutralizante b12 ou o epítopo de ligação ao CD4 fora do contexto da glicoproteína gp120. Para tal procedeu-se à construção de anticorpos de domínio, por meio de “grafting” da sequência alvo do anticorpo neutralizante b12 ou o epítopo de ligação ao CD4 num dos CDR’s, CDR1 ou CDR3 de um anticorpo de coelho de único domínio VL,.altamente estável. O potencial das construções VLB12 e VLCD4 foi testado para ligação ao CD4 por ELISA e por Citometria de Fluxo. A Citometria de Fluxo foi efectuada recorrendo a células HEK293T, HeLa-P4 e Jurkat, ambas as construções apresentam ligação ao receptor CD4, e o VLB12 CDR1, em particular, e parece ter uma ligação ao CD4 de elevada afinidade. A partir dos resultados de Citometria de Fluxo e dos rendimentos obtidos para as purificações as construções VLB12 CDR1 e VLCD4 CDR3 foram selecionados para análise posterior. Pretendeu-se também caracterizar o local de ligação das construções VLB12 CDR1 e VLCD4 CDR3 no receptor CD4, nomeadamente identificar qual o domínio do CD4 ao qual se ligam os anticorpos VLB12 e VLCD4. Para tal, realizaram-se ensaios de ELISA utilizando como antigénios que o receptor celular humano CD4 na sua forma solúvel, quer uma construção em que os domínios 1 e 2 do CD4 humano foram colocados em fusão com uma IgG2 humana na qual as regiões variáveis das cadeias leves e das cadeias pesadas foram substituidas pelos domínios 1 e 2 do CD4 humano dando origem a uma proteína de fusão designada CD4-IgG2. Dos ensaios de ELISA foi possivel concluir que ambos os anticorpos VLB12 e VLCD4 se ligam ou ao domínio 1 ou ao domínio 2 do CD4 humano. Para identificar especificamente a qual dos domínios se ligavam o VLB12 e o VLCD4, foram realizadas experiências em que células HEK293T foram transfectadas com CD4 humano (hCD4), CD4 de murganho (mCD4) ou com CD4 humano em que o domínio 1 foi substituido pelo domínio 1 de murganho (hCD4mD1). Estas células transfectadas com os diferentes receptores celulares CD4 foram submetidas a ensaios de Citometria de Fluxo para avaliação da ligação dos anticorpos VLB12 e VLCD4 aos diferentes receptores celulares CD4 e concluiu-se que o VLB12 se liga ao domínio 2 e que o VLCD4 se liga ao domínio v 1 do CD4 humano. Realizaram-se também ensaios de ELISa em que se verificou que os epitopos reconhecidos pelo VLB12 e pelo VLCD4 são ambos conformacionais. A fim de avaliar a capacidade do VLB12 e do VLCD4 na inibição da infecção por VIH-1, foram realizados ensaios de inibição com o clone molecular NL4-3 do VIH-1 (subtipo B) e com os subtipos J e H de isolados primários de VIH-1. Os ensaios de inibição foram realizados em células TZM-bl num ensaio de um ciclo único de infecção. O VLB12 foi capaz de inibir o VIH-1NL4-3 com um IC50 = 3,89 µM e o VLCD4 foi capaz de inibir o HIV-1NL4-3 com um IC50 = 6,57 µM. Realizaram-se igualmente ensaios de inibição com o T20 para o qual se obteve um IC50 = 0,0694 µM.Quanto aos isolados primários, o VLB12 foi capaz de inibir o VIH-1 subtipo H com um IC50 = 3,97 µM e o VIH-1 subtipo J com um IC50 = 3,86 µM, mas o VLCD4 não foi capaz de inibir os subtipo J e H de isolados primários de VIH-1. Para o T20 obteve-se um IC50 = 1,33 nanoM para o subtipo H do VIH-1 e para o subtipo J do VIH-1 obteve-se um IC50 = 0,42 nanoM. Estes resultados indicam que o VLB12 apresenta um amplo potencial de inibição ao contrário do VLCD4 que não foi capaz de inibir qualquer um dos isolados primários dos subtipo não B. Devido à elevada afinidade de ligação ao receptor CD4 apresentada pelo VLB12, uma das abordagens desta Tese teve por objectivo avaliar o potencial de um novo sistema de entrega de moleculas para terapia génica em que se utilizaram nanopartículas revestidas com VLB12 para avaliar a entrega de biomoléculas a células que expressam o receptor CD4. Foram testados dois tipos diferentes de formulações de nanopartículas, de quitosano e de PEI, para a entrega do plasmídeo FUGW-dsRed em células Jurkat. Ambas as formulações de nanopartículas foram bem sucedidos na entrega do plasmídeo FUGW-dsRed às células Jurkat, conforme determinado por imunofluorescência. A formulação de nanopartículas de quitosano provou globalmente ser mais eficaz, devido à reduzida toxicidade celular. A quantidade ideal de VLB12 adsorvido às nanopartículas deu origem a um aumento de 16% da população dsREd positiva vi fluorescente com um direccionamento das nanopartículas para o receptor alvo (CD4) devido à presença do VLB12. Numa abordagem distintadas anteriores, pretendeu-se avaliar as propriedades antigénicas do VLB12 para utilização numa formulação de vacina. Deste modo, a imunidade das mucosas foi testada utilizando o VLB12 encapsulado em nanopartículas de quitosano, por comparação com a via subcutânea, utilizando como adjuvante alumínio e realizando as mesmas formulações sem adjuvante. A resposta de IgG total específico nas amostras de soro foi avaliada por ELISA utilizando como antigénio o VLB12. Foram também avaliadas as respostas Th1 ou Th2 através do racio dos antigénios específicos IgG1-IgG2 nas amostras de soro. Para avaliar o potencial antigénico do VLB12 como vacina, foram realizados ensaios de inibição de VIH-1 usando os soros dos diferentes grupos de murganhos, aos quais foi administrado cada uma das formulações. Os ensaios de inibição foram realizados em células TZM-bl, com uma MOI de 0,1, num ensaio de um ciclo único de infecção. Apesar de os grupos vacinados apresentarem títulos de IgG específico elevados, nenhum dos soros obtidos apresentou efeito inibitório sobre o VIH-1NL4-3. Confirmou-se por ELISA que os soros obtidos não reconheciam a gp120 o que indica que a framework do VL é altamente imunogénica, não tendo sido obtida uma proporção de anticorpos dirigidos contra a região alvo b12 suficiente para se obter um efeito inibitório nos ensaios de inibição do VIH-1NL4-3. O anticorpo b12 é um dos poucos anticorpos monoclonais humanos conhecidos que pode eficientemente neutralizar uma ampla gama de isolados primários de VIH-1 in vitro e pode proteger contra o desafio viral in vivo. O objetivo deste trabalho foi a avaliação da sequência alvo do anticorpo neutralizante b12 ou o epítopo de ligação ao CD4 fora do contexto da glicoproteína gp120. Para tal procedeu-se à construção de anticorpos de domínio, por meio de “grafting” da sequência alvo do anticorpo neutralizante b12 ou o epítopo de ligação ao CD4 num dos CDR’s, CDR1 ou CDR3 de um anticorpo de coelho de único domínio VL,.altamente estável. O potencial das construções VLB12 e VLCD4 foi testado para ligação ao CD4 por ELISA e por Citometria de Fluxo. A Citometria de Fluxo foi efectuada recorrendo a células HEK293T, HeLa-P4 e Jurkat, ambas as construções apresentam ligação ao receptor CD4, e o VLB12 CDR1, em particular, e parece ter uma ligação ao CD4 de elevada afinidade. A partir dos resultados de Citometria de Fluxo e dos rendimentos obtidos para as purificações as construções VLB12 CDR1 e VLCD4 CDR3 foram selecionados para análise posterior. Pretendeu-se também caracterizar o local de ligação das construções VLB12 CDR1 e VLCD4 CDR3 no receptor CD4, nomeadamente identificar qual o domínio do CD4 ao qual se ligam os anticorpos VLB12 e VLCD4. Para tal, realizaram-se ensaios de ELISA utilizando como antigénios que o receptor celular humano CD4 na sua forma solúvel, quer uma construção em que os domínios 1 e 2 do CD4 humano foram colocados em fusão com uma IgG2 humana na qual as regiões variáveis das cadeias leves e das cadeias pesadas foram substituidas pelos domínios 1 e 2 do CD4 humano dando origem a uma proteína de fusão designada CD4-IgG2. Dos ensaios de ELISA foi possivel concluir que ambos os anticorpos VLB12 e VLCD4 se ligam ou ao domínio 1 ou ao domínio 2 do CD4 humano. Para identificar especificamente a qual dos domínios se ligavam o VLB12 e o VLCD4, foram realizadas experiências em que células HEK293T foram transfectadas com CD4 humano (hCD4), CD4 de murganho (mCD4) ou com CD4 humano em que o domínio 1 foi substituido pelo domínio 1 de murganho (hCD4mD1). Estas células transfectadas com os diferentes receptores celulares CD4 foram submetidas a ensaios de Citometria de Fluxo para avaliação da ligação dos anticorpos VLB12 e VLCD4 aos diferentes receptores celulares CD4 e concluiu-se que o VLB12 se liga ao domínio 2 e que o VLCD4 se liga ao domínio v 1 do CD4 humano. Realizaram-se também ensaios de ELISa em que se verificou que os epitopos reconhecidos pelo VLB12 e pelo VLCD4 são ambos conformacionais. A fim de avaliar a capacidade do VLB12 e do VLCD4 na inibição da infecção por VIH-1, foram realizados ensaios de inibição com o clone molecular NL4-3 do VIH-1 (subtipo B) e com os subtipos J e H de isolados primários de VIH-1. Os ensaios de inibição foram realizados em células TZM-bl num ensaio de um ciclo único de infecção. O VLB12 foi capaz de inibir o VIH-1NL4-3 com um IC50 = 3,89 µM e o VLCD4 foi capaz de inibir o HIV-1NL4-3 com um IC50 = 6,57 µM. Realizaram-se igualmente ensaios de inibição com o T20 para o qual se obteve um IC50 = 0,0694 µM.Quanto aos isolados primários, o VLB12 foi capaz de inibir o VIH-1 subtipo H com um IC50 = 3,97 µM e o VIH-1 subtipo J com um IC50 = 3,86 µM, mas o VLCD4 não foi capaz de inibir os subtipo J e H de isolados primários de VIH-1. Para o T20 obteve-se um IC50 = 1,33 nanoM para o subtipo H do VIH-1 e para o subtipo J do VIH-1 obteve-se um IC50 = 0,42 nanoM. Estes resultados indicam que o VLB12 apresenta um amplo potencial de inibição ao contrário do VLCD4 que não foi capaz de inibir qualquer um dos isolados primários dos subtipo não B. Devido à elevada afinidade de ligação ao receptor CD4 apresentada pelo VLB12, uma das abordagens desta Tese teve por objectivo avaliar o potencial de um novo sistema de entrega de moleculas para terapia génica em que se utilizaram nanopartículas revestidas com VLB12 para avaliar a entrega de biomoléculas a células que expressam o receptor CD4. Foram testados dois tipos diferentes de formulações de nanopartículas, de quitosano e de PEI, para a entrega do plasmídeo FUGW-dsRed em células Jurkat. Ambas as formulações de nanopartículas foram bem sucedidos na entrega do plasmídeo FUGW-dsRed às células Jurkat, conforme determinado por imunofluorescência. A formulação de nanopartículas de quitosano provou globalmente ser mais eficaz, devido à reduzida toxicidade celular. A quantidade ideal de VLB12 adsorvido às nanopartículas deu origem a um aumento de 16% da população dsREd positiva vi fluorescente com um direccionamento das nanopartículas para o receptor alvo (CD4) devido à presença do VLB12. Numa abordagem distintadas anteriores, pretendeu-se avaliar as propriedades antigénicas do VLB12 para utilização numa formulação de vacina. Deste modo, a imunidade das mucosas foi testada utilizando o VLB12 encapsulado em nanopartículas de quitosano, por comparação com a via subcutânea, utilizando como adjuvante alumínio e realizando as mesmas formulações sem adjuvante. A resposta de IgG total específico nas amostras de soro foi avaliada por ELISA utilizando como antigénio o VLB12. Foram também avaliadas as respostas Th1 ou Th2 através do racio dos antigénios específicos IgG1-IgG2 nas amostras de soro. Para avaliar o potencial antigénico do VLB12 como vacina, foram realizados ensaios de inibição de VIH-1 usando os soros dos diferentes grupos de murganhos, aos quais foi administrado cada uma das formulações. Os ensaios de inibição foram realizados em células TZM-bl, com uma MOI de 0,1, num ensaio de um ciclo único de infecção. Apesar de os grupos vacinados apresentarem títulos de IgG específico elevados, nenhum dos soros obtidos apresentou efeito inibitório sobre o VIH-1NL4-3. Confirmou-se por ELISA que os soros obtidos não reconheciam a gp120 o que indica que a framework do VL é altamente imunogénica, não tendo sido obtida uma proporção de anticorpos dirigidos contra a região alvo b12 suficiente para se obter um efeito inibitório nos ensaios de inibição do VIH-1NL4-3.
The HIV-1 entry process is mediated by the Env proteins, and begins with the binding of gp120 to the CD4 cellular receptor. A recent discovery has identified in gp120 a conformationally invariant surface that overlaps a distinct subset of the CD4-binding site, which is a binding site for the b12 natural antibody. The goal of this work was to evaluate both the b12 target sequence and the CD4 binding epitope outside of the gp120 context and to evaluate the potential for CD4 binding of these two epitopes individually. This was done through grafting of the b12 target sequence or CD4 binding epitope into either CDR1 or CDR3 of a highly stable VL antibody. The potential of the VLB12 and VLCD4 constructs was tested for CD4 binding by ELISA assay and Flow Citometry analysis; both graftings present binding to the CD4 receptor and VLB12, in particular. In order to evaluate the VLB12 and VLCD4 ability to inhibit HIV-1 infection, inhibition assays were performed with the HIV‐1NL4‐3 subtype B molecular clone and with HIV‐1 subtypes J and H primary isolates. VLB12 was able to inhibit HIV‐1NL4‐3 with an IC50 = 3,89 µM and VLCD4 was able to inhibit HIV‐1NL4‐3 with an IC50 = 6,57 µM. As for the HIV‐1 primary isolates, VLB12 was able to inhibit subtype H with an IC50 = 3,97 µM and subtype J with an IC50 = 3,86 µM but VLCD4 was not able to inhibit either subtype J or subtype H. These results indicate that VLB12 presents potentially a broad inhibition spectrum as opposed to VLCD4 that was not able to inhibit either of the non subtype B primary isolates. Due to the VLB12 high binding affinity to the CD4 receptor the potential of VLB12 coated nanoparticles as a new therapeutic delivery system was evaluated. Chitosan and PEI nanoparticle formulations were tested, for the delivery of FUGW-dsRed plasmid to Jurkat cells. Both nanoparticle formulations were successful in delivery of specific CD4 targeted FUGW-dsRed as determined by immunofluorescence. Chitosan nanoparticle formulation proved to be more effective due to the lower cell toxicity. The optimal amount of VLB12 adsorbed to the nanoparticles gave a 16 % positive dsREd fluorescent population with specific VLB12 targeting. viii To evaluate the vaccine antigen properties, of VLB12 the mucosal immunity was tested by using encapsulated VLB12 in nanoparticles of chitosan in comparison with subcutaneous routes with aluminium adjuvant and without adjuvant. Th1 or Th2 responses were evaluated by the ratio of antigen-specific IgG2a-IgG1 in the serum samples. HIV-1 neutralization assays using serum from different groups to evaluate the VLB12 as potential vaccine antigen were performed but the serum presented no inhibitory effect on HIV-1NL4-3.
Descrição: Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/5506
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