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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/5650

Title: Development of a virus-like particle based vaccine: a conjugated antigen-presenting platform
Authors: Tomaz, David Caetano Duarte Filipe, 1985-
Advisor: Gervais, David, 1943-
Tenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade, 1952-
Keywords: Virologia
Imunologia
Vacinas
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Abstract: The high level of immunogenicity of peptides displayed in dense repetitive arrays on virus-like particles (VLPs) makes engineered VLPs promising vaccine carriers. Here, we describe a platform for vaccine development based on a confidential VLP named “X”. Towards this goal, X VLPs were produced by the baculovirus expression system (BEV) and examined for attachment of foreign antigenic peptides. Two distinct gene versions of the major capsid protein, viral protein 2 (VP2), were separately cloned into pFastBac1 to construct both wild type (WT) and mutant (MT) recombinant donor plasmids. These plasmids were transformed into DH10Bac E. coli competent cells for transposition and recombinant bacmids (rbacmids) were generated. The bacmids plasmid DNA were then purified and transfected into Sf9 insect cells to produce WT and MT X VLPs. X VLP VP2 expression was analyzed by SDSPAGE, X VLPs were identified by mass spectrometry and particle assembly was confirmed through transmission electron microscopy (TEM) and high performance liquid chromatography (HPLC). Both WT and MT VP2 were expressed in insect cells and shown to assemble. An original VLP’ purification method was developed in which two separate, sequential, anion exchange and size-exclusion chromatography processes were applied. In order to covalently attach small (ca. 16 aminoacids in length) antigen peptides to the outer surface of VLP, a chemical conjugation technique was employed using a heterobifunctional chemical linker succinimidyl-6-[(ß-maleimidopropionamido)hexanoate] (SMPH). VLPs were purified and successfully conjugated to antigenic peptides. Antibody sera obtained from murine immunization against Y001-conjugated to an alternative VLP platform, showed antigenicity recognising the same antigenic peptide, Y001, covalently linked to X VLP. In this work, we explored whether X VLP expression, purification and bioconjugation may be used in a future biotherapeutic application. Together, these results suggest X VLP can potentially be exploited as an antigen carrier for the development of new VLP-based vaccines.
Os vírus constituem excelentes modelos à nanotecnologia representando por excelência plataformas de interacção comuns a todos os sistemas biológicos. Uma das suas aplicações mais relevantes assenta na utilização única do seu invólucro exterior, formando partículas do tipo viral semelhantes aos vírus de que derivam, normalmente de constituição proteica e sem potencial patogénico. As partículas do tipo viral são já actualmente usadas como vacinas. Neste trabalho, descrevemos o desenvolvimento de uma partícula do tipo viral, composta a partir de um vírus X (confidencial), e a sua possível aplicação como partícula apresentadora de antigénios, vacina modificada. Os processos de expressão, purificação e transformação final por bioconjugação dos X VLPs (do inglês, virus-like particles) são analisados neste trabalho. Contextualização teórica Algumas das aplicações virais mais importantes sustentam-se no facto dos vírus serem entidades dinâmicas e de metastabilidade, propriedades estas que são conferidas, em parte, pelo seu invólucro ou cápside externa de arquitecturas homogéneas e simétricas. De facto, a manipulação química e genética das superfícies externas dos VLPs torna possível a inclusão de novas funcionalidades à arquitectura proteica da partícula e às propriedades que lhes são inerentes. Assim, o princípio que demonstra a possibilidade de modificação de grupos reactivos e ligação de péptidos às superfícies exteriores das cápsides virais foi já provado e desenvolvido em diferentes estudos. Os blocos estruturais virais de construção, as subunidades ou monómeros constituintes, permitem, com relativa facilidade, tanto modificações químicas como genéticas (e.g. bioconjugação química). A modificação de resíduos de aminoácidos, ou outros grupos reactivos ou ligandos, em pontos específicos das partículas do tipo viral, têm sido utilizados para ligações sítio-específicas de pequenas moléculas, incluindo nanopartículas de ouro, fluoróforos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos e péptidos. Desta forma, a cápside é o local primário de interface exterior viral que define muitas das suas propriedades moleculares, e de interacção imunológicas, útil a diferentes aplicações baseadas em VLPs para vacinas ou imunoterapêuticos. Partículas do tipo viral Os VLPs são compostos, pelo menos, por uma proteína viral e resultam da montagem (assembly) das diferentes subunidades, em ordem repetitiva, em estruturas geralmente icosaédricas ou bacilares. Estas partículas, mesmo não possuindo qualquer potencial patogénico e não comportando em si qualquer informação genética com capacidade replicativa, conseguem induzir respostas imunitárias potentes, devido ao facto de se assemelharem a uma partícula viral infecciosa e de apresentarem proteínas com a mesma conformação que um vírus infeccioso. Assim sendo, os VLPs podem activar tanto uma resposta imunitária (i) à produção de anticorpos neutralizantes, de suporte a uma acção memória profiláctica, (ii) como uma resposta de efeito terapêutico, associada a acção citotóxica e predominantemente dependente de linfócitos T. Muitos VLPs têm sido adquiridos a partir de vários vírus, desde vírus animais e de plantas, bacteriófagos, Ty retrotransposões de levedura e podem ser expressos em diferentes modelos hospedeiros incluindo bactérias, leveduras, plantas e células de insecto e mamífero. VLPs como plataformas de apresentação antigénica Os VLPs em vacinação são geralmente explorados como partículas subvirais naturais, ou seja, são empregues para despoletar uma resposta imunitária contra as proteínas que constituem o próprio vírus de que derivam. Contudo, estes podem igualmente ser usados como plataformas de apresentação antigénica, levando ao desenvolvimento de respostas imunitárias contra qualquer antigénio alvo apresentado, associado a diferentes alvos terapêuticos ou agentes infecciosos. Os VLPs podem ser empregues como veículos de apresentação antigénica de epítopos tanto para as células B como T. Diferentes métodos podem ser utilizados no processo de apresentação de antigénios à superfície de VLPs, sendo os mais comuns a ligação química covalente ou fusão genética. A fusão genética é normalmente útil para pequenos epitopos péptidicos, enquanto que a conjugação covalente química é geralmente usada para antigénios maiores, em particular pequenas proteínas. Por exemplo, VLPs derivados do bacteriófago Qβ conjugados com nicotina, ou angiotensina II, foram já desenvolvidos por bioconjugação química. Por fusão genética, assembled vírus do papiloma bovino, VLPs quimeras estáveis, foram já modificados para a apresentação de epítopos do vírus do papiloma humano. Recentemente tem sido demonstrado que uma das formas mais eficientes de carregar e conjugar um VLP com antigénios estranhos para exposição ao sistema imunitário é através de ligação química covalente. Essa ligação é feita com o uso de ligandos heterobifuncionais, contendo duas extremidades funcionais diferentes. Um lado do ligando liga-se ao VLP e o outro ao antigénio de interesse. Como exemplo, grupos amina de resíduos de lisinas, expostos à superfície de VLPs existentes no bacteriófago Qβ, são primariamente reactivos com um ester amina reactivo de Nhydroxysuccinimide (NHS) do ligando heterobifunctional succinimidyl-6-((β-maleimidopropionamido) hexonoate)) (SMPH) preservando a actividade do seu grupo maleimida, sulfidril reactivo, mantendose assim livre para se ligar a um outro antigénio, sulfidril reactivo, por exemplo, um alvo cisteína presente numa pequena sequência péptidica. Para assegurar que o antigénio está acoplado directamente ao VLP e que se apresenta numa forma ordenada, os antigénios peptídicos podem ser modificados para conter tanto um grupo terminal amina como um grupo terminal carboxilo na sua sequência contendo um grupo livre de resíduo de cisteína. De forma semelhante, os VLPs provenientes de qualquer outra origem podem ser mutados para incorporar residuos de aminoácidos reactivos para conjugação. Objectivos: Este trabalho teve como objectivo a expressão e produção de X VLPs, a sua purificação e posterior modificação da interface externa para conjugação de péptidos de potencial antigénico, ligados covalentemente à superfície externa do VLP e expostos ao exterior para reconhecimento imunológico. Material e Métodos: Duas versões distintas da proteína viral 2 (VP2) do vírus X, foram separadamente clonadas em pFastBac1 para construir tanto a versão selvagem, WT (do inglês, wild type) como uma versão modificada, MT (do inglês, mutant) de X VLPs. Estes plasmídeos foram transformados numa estirpe competente DH10Bac de E. coli para transposição e formação de bacmids recombinantes. O ADN plasmídico dos rbacmids purificados foi transfectado para células de insecto Sf9 para a expressão de duas versões distintas de X VLPs. A expressão de VP2 foi analisada por SDS-PAGE, os VLPs foram identificados por espectrometria de massa e o seu assembly confirmado através de microscopia electrónica de transmissão e cromatografia líquida de alta performance. Um método original de purificação de X VLPs foi desenvolvido no qual dois processos cromatográficos sequenciais de cromatografia de troca iónica e de exclusão molecular foram empregues. Para a ligação covalente, conjugação de X VLPs com péptidos antigénicos de 16 aminoácidos, uma técnica de bioconjugação química foi usada com a utilização do ligando heterobifuncional succinimidyl-6-[(ß-maleimidopropionamido)hexanoate] (SMPH). Resultados: As duas versões de X VLPs, WT e MT, foram produzidas com sucesso em células de insecto. X VLPs foram purificados e conjugados com o péptido antigénico desejado. Soro obtido a partir da imunização com um outro tipo de VLPs conjugados, mas para o mesmo péptido antigénico, continham anticorpos reactivos para ambas as versões conjugadas de X VLPs, evidenciando o êxito da conjugação, (ligação dos péptidos à superfície externa dos VLPs). Conclusão: Neste trabalho é pela primeira vez descrito um método original para a purificação de X VLPs e é demonstrada a capacidade de ligação, à superfície externa dos X VLPs, de pequenos péptidos antigénicos de 16 aminoácidos de comprimento, por ligações covalentes. Assim, estes resultados sugerem que os X VLPs podem ser explorados como veículos de apresentação antigénica e demonstram potencial para diferentes abordagens terapêuticas para reconhecimento ao sistema imunológico.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada ). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/5650
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