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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/5682

Título: Supervised and unsupervised spermatozoa detection, classification and tracking in imaging data
Autor: Silva, Pedro Ângelo Pereira da, 1985-
Orientador: Carneiro, Albino Cadeias Araújo
Martins, Gabriel José Gonçalves
Palavras-chave: Bioinformática
Imagiologia
Espermatozóides
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Resumo: A aplicação da matemática na pesquisa em biologia tem vindo a ganhar relevância nas últimas décadas. Vários estudos teóricos e quantitativos têm contribuído para o progresso da biologia celular, da biologia do desenvolvimento e da imunologia. Os modelos matemáticos são particularmente úteis em casos onde a regulação genética afecta as propriedades biofísicas da célula e um exemplo é o estudo da biomecânica e hidrodinâmica dos espermatozóides. No entanto, a inexistência de comparações quantitativas rigorosas entre estes modelos e os dados experimentais torna este processo difícil e enviesado. Isto é devido à comparação maioritariamente qualitativa e visual, onde os parâmetros são mudados até o modelo e os dados serem semelhantes. As simulações de células contêm toda a informação geométrica dos objectos que descrevem pelo que podem ser rigorosamente comparadas com as imagens e filmes. Por outro lado, a reconstituição de células é dificultada pelos processos de análise de imagens actuais, que têm um fraco desempenho e que necessitam de supervisão humana. Este último ponto torna a análise de grande quantidade de dados difícil e introduz subjectividade e enviesamento na análise. Desta forma, os avanços na biologia celular quantitativa dependem do desenvolvimento de novos métodos automáticos de análise de imagem. Os sistemas de análise de espermatozóides assistida por computação (CASA) são um bom exemplo onde a bioimagiologia e a sua análise automática foram combinadas com sucesso. Estes sistemas apareceram nos anos 70 e são baseados na análise populacional dos parâmetros de motilidade dos espermatozóides. A sua popularidade advém da sua importância nos sectores médico e económico, uma vez que um em cada seis casais é subfértil e metade dos casos são de origem masculina. A motilidade espermática é essencial para a fertilização. Na viagem até ao ovo, as células espermáticas têm que nadar numa extensão milhares de vezes o seu comprimento através de uma geometria interna complexa cheia de fluídos altamente viscosos e de células imunes potencialmente hostis. Começando com uma população de centenas de milhões, a grande maioria não chegará às trompas de Falópio e muito menos chegarão ao local onde ocorre a fertilização. Adicionalmente, a capacitação espermática e a reacção acrossómica são dois eventos que ocorrem durante esta viagem que podem ser usados para definir a capacidade de fertilização, uma vez que também são essenciais para que esta ocorra. A capacitação prepara a membrana do espermatozóide para receber futuras pistas de localização do óvulo enquanto que a reacção acrossómica liberta enzimas para que o espermatozóide possa penetrar na camada protectora do óvulo enquanto também prepara a membrana espermática para a fusão das duas células. Para além da motilidade espermática, uma abordagem prática para estudar a fertilização tem sido medir a taxa de resposta dos espermatozóides à indução da reacção acrossómica. Actualmente, esta habilidade é medida manualmente em preparações de células espermáticas fixadas e coradas de forma a visualizar o acrossoma, um complexo derivado do Golgi localizado no ápice da célula. Sendo um parâmetro comum e frequentemente usado em pesquisa científica, neste trabalho desenvolvemos um processo automático de classificar os espermatozóides de acordo a reacção acrossómica. O nosso classificador baseia-se na análise de discriminantes, um método que define funções de fronteira entre duas ou mais classes, de acordo com os factores providenciados. Definimos duas classes: Capacitadas, que são células que sofreram capacitação mas que ainda não passaram por nenhum estado de reacção acrossómica, e Reagidas, que já reagiram ou que ainda estão a reagir. Como características escolhemos a intensidade média de sete sub-áreas da cabeça do espermatozóide, dispostas ao longo do seu eixo maior. Primeiro testámos se a Análise de Discriminantes Lineares (LDA) e Análise de Discriminantes Quadráticos (QDA) seriam aceitáveis para classificar este tipo de reacção em células detectadas manualmente. A classificação por QDA teve resultados melhores do que a por LDA, classificando correctamente 98.0% das células, tendo sido seleccionado como modelo de classificação. Tendo em vista uma verdadeira automatização, testámos o mesmo método com células detectadas por segmentação automática da imagem, onde estimámos os parâmetros do módulo de detecção (filtragem de objectos) e classificámos correctamente 94.7% dos objectos que correspondiam a um e apenas um espermatozóide cuja classe era conhecida. No entanto, o processo automático classifica todos os objectos detectados resultando numa classificação todos esses objectos obtivemos um erro de 28.1% na frequência relativa de espermatozóides Reagidos, que é uma diferença significativa. Este erro é maioritariamente devido aos espermatozóides anotados manualmente cuja classe era dúbia, pelo que não foram atribuídos a nenhuma classe. É razoável assumir que todos os espermatozóides dúbios sejam na verdade células que começaram recentemente a reagir e que deverão pertencer à classe Reagidos. Desta forma o erro na frequência de Reagidos obtido é de apenas -2.4%. A eficiência na classificação dos objectos detectados automaticamente cujas classes eram conhecidas e o facto de o classificador ter classificado as dúbias como Reagidas apoia esta hipótese. Provavelmente, é necessário treinar o modelo de classificação com dados anotados por um especialista na área da reacção acrossómica para poder generalizar o nosso modelo correctamente. É ainda de salientar que, pelo nosso processo, detectámos apenas 49.0% das células, uma vez que muitas detecções tratavam-se de facto de agregados celulares. Este agregados foram filtrados antes da classificação pois iriam enviesar a classificação. Para evitar este problema, propomos o uso de preparações com menos densidade celular, diminuindo o número e tamanho das agregações e permitindo melhor detecção e resultados mais fiáveis. A maioria dos métodos actuais de detecção de espermatozóides (i.e. incluindo o nosso) sofrem do mesmo problema: resolver as células quando estão agregadas. Com o intuito de ultrapassar as suas limitações, desenvolvemos um novo algoritmo de detecção. O nosso método visa tirar partido da informação do espermatozóide, como conhecimento a priori, e da informação contida em imagens de série temporal, podendo ser também aplicado em imagens isoladas, como demonstramos. A ideia base é aplicar uma função que descreva a forma e movimento do espermatozóide ao longo do tempo à célula na imagem, estimando os parâmetros dessa função através da posição e forma de potenciais objectos nessas imagens. Se o melhor ajuste da função for bom, é muito provável que um espermatozóide se encontra nas posições e com as formas modeladas. Devido à complexidade em desenvolver, ajustar e validar um modelo baseado em equações diferenciais, neste trabalho tabelámos a posição, rotação e conformação flagelar dum espermatozóide de ouriço-do-mar da espécie Lytechinus pictus. Para validar o nosso método, tentámos detectar o espermatozóide tabelado usando apenas uma imagem (i.e. ajuste local) e ainda rastreá-lo ao longo do tempo (i.e. ajuste global). Tanto a detecção como o rastreamento foram eficazes. Para generalizar este modelo, usámos um filme de um espermatozóide de Strongylocentrotus purpuratus (i.e. outro ouriço-do-mar) e conseguimos detectar e rastrear essa mesma célula, tendo havido apenas uma pequena acumulação de erro nos últimos tempos de amostragem que poderá ser devido à diferença inter-espécie ou a este espermatozóide não ter uma dinâmica estacionária (i.e. a nadar em círculos com a frequência flagelar constante). Podemos iterar o processo global em todas as imagens e seleccionar as instâncias do modelo correspondentes ao mesmo espermatozóides, ou seja, a mesma célula mas fitado localmente em imagens/tempos diferentes, de forma a obter o melhor modelo do espermatozóide nesse filme. Este processo de ajuste local pode ser usado em imagens isoladas (i.e. independência espacial) e, consequentemente, para detectar os espermatozóides humanos usados na classificação, desde que o espermatozóide tabelado seja ajustado. Uma questão interessante é se o nosso modelo consegue aumentar a resolução temporal e espacial da microscopia. Analisando uma sub-amostra temporal conseguimos detectar e rastrear a célula correctamente, tendo o nosso modelo sido coerente com os tempos de amostragem não usados para ajustar os parâmetros. De modo semelhante, conseguimos ainda obter boas estimativas da posição do flagelo em imagens onde apenas a informação da cabeça estava disponível (i.e. os flagelos não eram visíveis). No entanto, das várias instâncias do modelo referentes a esse espermatozóide, não conseguimos escolher a que mais se aproximava à célula, pelo que é necessário um método de selecção diferente que inclua mais informação. Os métodos desenvolvidos podem ser integrados em modelos morfodinâmicos, onde forma, mecânica e sinalização são combinados, e revolucionar os sistemas CASA, que estão até à data por integrar motilidade e processos bioquímicos.
Recent advances in microscopy, by allowing to visualize cells and tissues in their natural physiological context, expanded the research possibilities to unprecedented domains. However, progress is hindered by the virtual absence of automatic image analysis methods that extract quantitative information from images. At best, image analysis is based on semi-automatic methods that require human supervision which is subjective and biased. This is how spermatozoa research stands at the moment and here we address three major computational issues in sperm imaging research: classification, detection and tracking. Sperm capacitation, acrosomal reaction and motility play an important role in fertility, which is a subject of growing medical and economic importance. In sperm research, acrosomal reaction is commonly measured by image analysis but, since no automatic classifier exists, it is performed manually. We developed and compared a method based on Discriminant Analysis capable of distinguishing capacitated cells which have not undergone acrosomal reaction from cells which are reacting or have reacted with over 94% of efficiency. The major difficulty encountered was automatic spermatozoa detection and a method to detect and track was devised - detect while tracking. This method uses a model of a sperm cell as a priori knowledge and can define well the sperm flagella position. We showed it can also predict sperm cells and their flagella at higher temporal resolution than the image sequence under study. It also has the potential to estimate flagellar conformations when only the sperm head positions are available but more sources of information are required in order to get the right conformation. Our methods modules can be easily adapted to any experimental setting (i.e. different labelling or sperm cell model) and the methods themselves can be combined to each other or to other available methods in order to facilitate sperm research.
Descrição: Tese de mestrado. Bioinformática e Biologia Computacional (Biologia Computacional). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/5682
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