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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/5765

Título: Lentiviral target-specific strategy for molecular therapy
Autor: Fonseca, Lídia Maria dos Santos, 1977-
Orientador: Gonçalves, João, 1967-
Palavras-chave: Teses de doutoramento - 2012
Issue Date: 2012
Resumo: A crucial factor for successful gene therapy is the efficacy of specific gene transfer, which is usually done by lentiviral vectors. Binding specificity and fusion of lentiviral vectors must be provided by envelope glycoprotein domains. The Sindbis virus envelope can pseudotype lentiviral particles and display exogenous protein domains. Previous results from this lab demonstrated that Sindbis envelope can accommodate anti-receptor single-chain antibodies (scFv) and target via cell-specific viral infection. In addition, Dr Irvin Chen laboratory has shown that Protein A-chimeric Sindbis envelope can specifically target cells immunolabelled with anti-receptor IgG via Fc recognition. However, these strategies might present some problems for in vivo applications, since there may be non-specific reactions with plasma antibodies and the need for cloning a receptor specific antibody each time a new molecule needs to be targeted. To overcome these problems we developed a new lentiviral vector capable of transducing several cell types in a specific manner without the above constraints, that consists of a chimeric scFv-Sindbis virus envelope that binds fluorescein isothiocyanate (FITC) with high affinity and consequently recognize FITC-conjugated proteins. Therefore, a target cell expressing on its surface a receptor targeted by FITCconjugated IgG can be infected by this scFv-Sindbis envelope pseudotyped lentiviral vector. Anti-FITC scFv was successfully incorporated at the surface of Sindbispseudotyped lentiviruses and could bind to FITC-labelled cells. Using this targeting strategy, we were able, in vitro, to target efficiently and specifically Jurkat cells labelled by a CD7 FITC-conjugated antibody. Moreover, we could specifically kill those transduced cells using an HSV-TK/GCV suicide gene strategy. The in vivo efficiency of this gene therapy proposal was tested in a mouse model of T-cell acute lymphoblastic leukaemia (T-ALL), which allowed targeting 15.2% of the tumour cells. This provides an alternative strategy to deliver molecular therapeutics using a modular specific targeting with lentiviruses. Moreover, it will overcome the need for new scFv cloning each time a new cell receptor must be targeted and it will avoid the competition by serum antibodies when applied in vivo, since the chimeric envelope will only recognize an organic molecule not present in the serum. Although the Lentiviral target-specific strategy for molecular therapy vi strategy herein proposed was applied to a leukaemia model it has the potential to be applied to a broad range of diseases.
Um factor crucial para realizar uma terapia génica com sucesso e a transferência especifica e eficaz de genes, o que normalmente e conseguido através do uso de vectores lentivirais. A especificidade de reconhecimento do alvo e o processo de fusao dos vectores lentivirais deve ser realizado pelas glicoproteínas do involucro viral. A glicoproteína do invólucro do vírus Sindbis pode pseudotipar lentivírus e apresentar na sua estrutura domínios exógenos de proteínas. Resultados anteriores deste laboratório demonstraram que o involucro do Sindbis pode acomodar na sua estrutura um fragmento de anticorpo (scFv) que reconhece receptores presentes na superfície celular infectando especificamente esse tipo de células através de um mecanismo alvoespecífico. Para além disso, o laboratório do Doutor Irvin Chen mostrou que a glicoproteína quimérica Sindbis-Proteína A pode reconhecer especificamente as células marcadas previamente com IgG, através de um reconhecimento da região Fc da imunoglobulina. No entanto, essas estratégias podem apresentar alguns problemas quando aplicadas in vivo, pois pode haver competição inespecífica por parte de anticorpos em circulação, para além da necessidade de se clonar um novo scFV receptor-específico cada vez que se queira fazer o reconhecimento de uma nova molécula. Para ultrapassar estes problemas, desenvolveu-se um novo vector lentiviral capaz de transduzir vários tipos de células de uma maneira específica e sem as restrições acima mencionadas, que consiste na incorporação no involucro do vírus Sindbis de um scFv que reconhece com elevada afinidade a fluoresceína (FITC) e, consequentemente, e capaz de reconhecer proteínas conjugadas com FITC. Assim, qualquer molécula da superfície de uma célula alvo que seja marcada com um anticorpo conjugado com FITC, sera identificada e especificamente infectada por este vector lentiviral. Este anti-FITC scFv foi incorporado com sucesso a superfície de lentivírus pseudotipados com o envelope do Sindbis e foi capaz de reconhecer células marcadas com FITC. Usando esta estratégia in vitro, foi possível fazer o direccionamento, de uma forma eficiente e específica, de células Jurkat marcadas por um anticorpo CD7 conjugado com FITC. Alem disso, conseguiu matar-se especificamente as células transduzidas usando como estratégia o sistema HSV-TK / GCV. A eficiência in vivo desta proposta de terapia genética foi testada num modelo Lentiviral target-specific strategy for molecular therapy viii de ratinho de leucemia linfoblástica aguda das células T, o que permitiu “atingir” 15.2% das células tumorais. Esta proposta de investigação vai fornecer os meios para uma entrega eficiente de bioterapias alvo-especificas utilizando uma estratégia modular de reconhecimento. Além disso, com este sistema deixa de ser necessário realizar novas clonagem de scFv para cada vez que se pretenda fazer o direccionamento para um receptor celular diferente e também evita a competição com anticorpos existentes no soro, quando aplicado in vivo, uma vez que o envelope quimérico só irá reconhecer uma molécula orgânica que não esta presente no soro. Apesar da estratégia aqui proposta ter sido aplicada a um modelo de leucemia ela tem potencial para ser aplicada a uma vasta gama de doenças.
Descrição: Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/5765
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