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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/5774

Title: Microsatellite characterization and marker development from massive sequencing data of the blenny Salaria pavo
Authors: Cardoso, Sara de Jesus Dias, 1988-
Advisor: Gonçalves, David
Falcão, André Osório e Cruz de Azerêdo
Keywords: Biologia molecular
Polimorfismos
Marcadores genéticos
Microssatélites
Salaria pavo
Bioinformática
Ria Formosa - Portugal
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: No blenídeo Salaria pavo o comportamento reprodutor de fêmeas e machos encontra-se modulado de acordo com a disponibilidade de ninhos no seu habitat. O sistema de acasalamento é promíscuo e os cuidados parentais às posturas são prestados exclusivamente por parte do macho. Nas populações de substrato rochoso onde existe uma grande disponibilidade de ninhos, os machos nidificam em cavidades na rocha e cortejam activamente as fêmeas, enquanto as fêmeas assumem um papel mais passivo. Por outro lado, a população da Ria Formosa apresenta consideráveis modificações ao padrão observado em costas rochosas. Nesta lagoa costeira, os substratos de nidificação são escassos e os únicos ninhos existentes são encontrados em tijolos utilizados na delimitação de áreas de cultivo de bivalves. A escassez de ninhos leva a que nesta população haja uma reversão dos papéis sexuais, com as fêmeas a cortejarem intensamente os machos e a competirem entre si pelo acesso a ninhos, e ao surgimento de tácticas alternativas de reprodução, com o aparecimento de machos parasitas. Estes machos apresentam um tamanho menor daqueles que nidificam e imitam tanto a morfologia como o comportamento de corte das fêmeas de modo a conseguirem aproximar-se do ninho e fertilizar as posturas durante episódios de desova. Estas tácticas alternativas de reprodução são sequenciais e os machos que apresentam uma táctica parasita numa época de reprodução normalmente adquirem um ninho na época seguinte. De forma a perceber a evolução e manutenção deste tipo de sistemas é necessário estimar o número de ovos que são fertilizados por machos parasitas. Actualmente a forma mais eficaz de fazer testes de paternidades é usando marcadores genéticos, que podem ou não ser complementados com observações de campo. De entre os vários marcadores existentes, o mais utilizado para este tipo de estudos é o microssatélite devido à elevada reproductibilidade dos resultados obtidos. Os microssatélites são motivos de 1 a 6 nucleótidos repetidos em tandem, altamente polimórficos e facilmente reproduzidos por PCR (Polymerase Chain Reation). Até recentemente, o isolamento de novos microssatélites para uma espécie dependia essencialmente da construção de bibliotecas genómicas enriquecidas para determinados microssatélites ou da reutilização de microssatélites de espécies próximas, tendo ambos os processos taxas de insucesso elevadas. Com o rápido desenvolvimento e disponibilização das tecnologias de sequenciação massiva à comunidade científica, uma nova forma de detectar e isolar microssatélites surgiu, a pesquisa in silico. De entre as várias plataformas de sequenciação massiva, a mais indicada para espécies que ainda não tenham sequências referência (genoma), é a pirosequenciação, por sequenciar fragmentos suficientemente longos (≈400 pb) que permitem a assemblagem de novo. Neste trabalho, o objectivo principal foi o de isolar e determinar o polimorfismo dos primeiros marcadores genéticos desenvolvidos para esta espécie. Para tal o transcriptoma deste blenídeo, que já se encontra sequenciado por pirosequenciação mas ainda não disponível nas bases de dados públicas, foi utilizado em conjunto com uma ferramenta bioinformática de pesquisa de microssatélites. Cerca de 640,000 sequências foram alinhadas de forma a se obter as 62,038 sequências consensus (unigenes com um tamanho médio de 452 pb) que foram utilizadas para fazer uma anotação funcional do transcriptoma e para a pesquisa de microssatélites. A anotação funcional foi realizada recorrendo a um algoritmo de alinhamento de sequências e procura de similaridades, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), mais concretamente o BLASTX, uma vez que se utilizou sequências nucleótidicas para pesquisas de semelhança na base de dados não redundante de sequências proteicas do NCBI. Utilizando um e-value<10-5, apenas 31% dos unigenes ficaram anotados funcionalmente e 21% tiveram termos do Gene Ontology atribuídos. Apesar de a percentagem de unigenes anotados ter sido baixa, a anotação realizada tem significado biológico uma vez que 80% das anotações obtidas foram provenientes de dezoito espécies de peixes. A pesquisa por microssatélites in silico resultou em 4,190 microssatélites identificados em 3,670 unigenes, usando como parâmetros de pesquisa microssatélites perfeitos com um mínimo de 6 repetições para todos os tipos de microssatélites (di-, tri-, tetra-, penta- e hexanucleótidos). Como acontece noutras espécies de peixes, os dinucleótidos são o tipo de microssatélites que se encontram em maior frequência (79%), seguidos dos trinucleótidos (19%). Os restantes tipos de microssatélites encontram-se em menor frequência correspondendo a apenas 6.5% do total de microssatélites. Qualquer que seja o processo utilizado para a obtenção de microssatélites, será sempre necessário testá-los e aplicá-los num conjunto de amostras de ADN de forma a poder avaliar o seu polimorfismo. Uma vez que neste trabalho interessava isolar microssatélites polimórficos, foram aplicadas duas estratégias de selecção dos microssatélites. A primeira estratégia utilizada baseou-se no conhecimento a priori do grau de polimorfismo dos microssatélites na população. Para tal, as sequências individuais que compõem o unigene na região do microssatélite foram manualmente curadas in silico de forma a avaliar o seu grau de polimorfismo. No total, 737 microssatélites revelaram ser polimórficos, dos quais 727 eram dinucleótidos e 6 trinucleótidos, com um número máximo de alelos observado in silico de 4 alelos. Para além do grau de polimorfismo também se teve em consideração nesta estratégia se o microssatélite estava num unigene anotado e com termos GO atribuídos e se era possível desenvolver um par de primers que o amplificassem. Depois da filtragem dos microssatélites pelos parâmetros mencionados anteriormente obteve-se uma lista de 97 dinucleótidos dos quais 33 foram seleccionados para aplicação (média de 8.5 repetições). A segunda estratégia para a selecção de microssatélites teve exclusivamente em conta o tamanho da repetição do microssatélite. Estudos anteriores apontam que microssatélites com mais repetições tendem a ser mais polimórficos e, desta forma, foram seleccionados 29 microssatélites para aplicação que continham em média 12 repetições. Para além dos 63 microssatélites seleccionados, outros 3 microssatélites isolados em Lipophrys pholis, pertencente à mesma subfamília do blenídeo Salaria pavo, foram também testados numa amostra de ADN de Salaria pavo para testar a sua amplificação heteróloga. De modo a testar a viabilidade de aplicação destes microssatélites para estudos de genética de populações, quarenta e um microssatélites, cujos primers amplificaram um só fragmento com o tamanho esperado, tiveram o seu primer forward marcado com fluorescência para a genotipagem de 20 indivíduos provenientes da população da ilha da Culatra (Portugal) e 6 indivíduos provenientes das ilhas de Formentera (Espanha) e Borovac (Croácia). Depois de analisados os resultados obtidos, 28 microssatélites isolados em Salaria pavo e 1 microssatélite isolado em Lipophrys pholis ficaram validados para futuros estudos. Na população da Culatra todos os microssatélites, à excepção de 5, microssatélites revelaram ser polimórficos. O número de alelos variou entre 2 e 12 alelos e a heterozigosidade observada e esperada variou entre 0.05 a 0.85 e 0.05 a 0.79 respectivamente. O número médio de alelos e a heterozigosidade esperada foi superior nos microssatélites seleccionados usando a segunda estratégia (6.5 e 0.62) comparativamente à primeira estratégia (3.54 e 0.40). Dois microssatélites revelaram estar em desequilíbrio de Hardy-Weinberg e 2 pares de microssatélites em desequilíbrio de linkage. Todos os microssatélites amplificaram nas amostras de ADN das populações de Formentera e Borovac. Tendo em conta os resultados obtidos, a segunda estratégia revelou ser mais eficiente para a selecção de microssatélites com maior taxa de polimorfismo. Apesar de os microssatélites monomórficos encontrados na população da Culatra terem sido isolados com base na primeira estratégia será necessário aumentar o número de indivíduos genotipados de forma a confirmar-se o grau de polimorfismo observado in silico.
Next-generation sequencing is providing researchers with a relatively fast and affordable option for developing microsatellite loci for non-model organisms. The number of studies using this approach is fast-growing and a new focus has been given to the development of microsatellites from cDNA due to their potential in targeting candidate genes (type I markers). When the microsatellite polymorphism is of interest, developing microsatellites can become time-consuming due to the numerous primer pairs to be tested for polymorphism by polymerase chain reaction (PCR) in the focal species. Assemblies have a new potential not yet fully explored for microsatellite mining and evaluation, which can help improve the polymorphism rates obtained. Their high sequence coverage enables to access the microsatellite polymorphism in silico, if the DNA library sequenced was obtained from a pool of DNA from various individuals of the focal species. Therefore, in this study the transcriptome assembly obtained with pyrosequencing for the blenny Salaria pavo, was mined for microsatellites and their polymorphism manually evaluated in silico. Two strategies emerged for microsatellite selection and application in a sample of 26 individuals from the islands of Culatra, Formentera and Borovac. Microsatellites were selected based on their in silico polymorphism and annotation results (first strategy) or based only on their repetition length (second strategy). From a set of 63 microsatellite loci isolated in Salaria pavo sequences, 28 were validated plus one microsatellite from Lipophrys pholis. All microsatellites, except 5, revealed to be polymorphic on the 20 individuals genotyped from Culatra Island, the focal population of study. With the results obtained in this work, the second strategy revealed to be more efficient in yielding polymorphic microsatellites than the first strategy (average number of alleles was 6.5 and 3.54 respectively). Nevertheless, merging these two strategies in future studies may help improving the polymorphism results and at the same time develop type I markers.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Bioinformática e Biologia Computacional). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/5774
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