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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/5880

Title: Genetic and epigenetic control of germline specification in Arabidopsis pollen
Authors: Borges, Filipe de Sousa
Advisor: Becker, Jörg D.
Feijó, José A., 1962-
Keywords: Arabidopsis
Polén
Metilação de ADN
MicroRNA
Teses de doutoramento - 2012
Issue Date: 2012
Abstract: In flowering plants the male gametes are embedded within the cytoplasm of the growing pollen tube, which transports them to the embryo sac where double fertilization occurs. Understanding the mechanisms and conditions by which sperm cells mature and take part in fertilization are crucial goals in the study of plant reproduction, epigenetic reprogramming and genomic imprinting. Analyses in the model plant Arabidopsis thaliana were hindered because no method to isolate sperm cells was available. We used Fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate sperm cells and vegetative nucleus from Arabidopsis pollen, allowing gene expression analysis at a genome-wide level by microarrays. Comparative analysis of the sperm cell transcriptome with those of representative sporophytic tissues and of entire pollen grains showed that sperm cells have a distinct and diverse transcriptional profile, functionally skewed towards DNA repair, ubiquitin-mediated proteolysis and cell cycle progression. Moreover, analysis of the small RNA and DNA methylation pathways suggested that distinct mechanisms might be involved in regulating the epigenetic state of the paternal genome. Transposable elements (TEs) are suppressed by epigenetic silencing and small interfering RNAs (siRNAs), especially in the gametes that contribute with genetic material to the next generation. In wild-type Arabidopsis pollen, TEs are reactivated and transpose, but only in the vegetative nucleus, which does not provide DNA to the fertilized zygote. TE expression coincides with down-regulation of key elements involved in heterochromatin formation, and many TE-derived siRNAs. However, 21nt siRNAs from Athila retrotransposons are generated and accumulate in pollen and sperm, suggesting that siRNA from TEs activated in the vegetative nucleus may target silencing in gametes. We profiled DNA viii methylation of the three different types of nuclei observed through pollen maturation, from the post meiotic precursor cell to the mature pollen grain in an attempt to understand epigenetic reprogramming during plant germline development. CG and CHG methylation is reduced in the vegetative cell comparing with that of sperm and microspore, but only at specific loci, which tend to mark TEs surrounding some noted imprinted genes. This indicates that symmetric methylation in the microspore is maintained during DNA replication in the first pollen division, and actively lost at imprinted loci. Intriguingly, CHH methylation, which is tied to RNA-directed DNA methylation (RdDM), is much lower in sperm nuclei than in the vegetative nucleus, overlapping with the accumulation of correspondent siRNAs in pollen. There is a particular subset of RC/Helitron and DNA/MuDR elements that are rich in siRNAs and CHH methylation while maintaining CG and CHG methylation levels, and a second subset of elements that are devoid of siRNAs and CHH methylation, and actively lose CG and CHG. These results suggest that in the VN, DNA demethylation occurs only at TE loci that are not actively targeted by RdDM, in a mechanism that might be involved in reestablishing imprinting marks. From plants to animals, there is contradictory evidence on the importance of microRNAs (miRNAs) during germ cell development. While most of the core proteins involved in the miRNA pathway in plants have been identified in the Arabidopsis sporophyte, there is very limited understanding about potentially distinct mechanisms of posttranscriptional regulation between different cell lineages. We provide a robust comparative analysis of miRNAs identified in sperm cells and pollen by deep sequencing, using molecular tools to deplete their function along germ cell specification and beyond fertilization. In addition, we present the identification of 25 potentially novel miRNAs processed in the male gametophyte and sperm cells, as well as enriched variations in the sequence length of known ix miRNAs that might indicate sub-functionalization by association with a putative germlinespecific Argonaute complex. ARGONAUTE 5 (AGO5), by close homology to AGO1 and localizing preferentially to the sperm cell cytoplasm in mature pollen, may be part of such a complex. MicroRNA targets are not misregulated in ago5-4 pollen, indicating that AGO5 is not part of the canonical miRNA pathway during pollen development. In alternative and similarly to what had been previously reported for AGO10, our data suggests that AGO5 could be involved in miRNA sequestering, thus preventing post-transcriptional gene silencing in the sperm cells. Moreover, AGO5 may be additionally involved in transcriptional gene silencing by RdDM, as some genes up-regulated in the mutant are flanked by TEs and repeat sequences targeted by RdDM.
Em plantas superiores, os gâmetas masculinos encontram-se no interior da célula vegetativa do pólen, e são transportados pelo tubo polínico até ao saco embrionário onde ocorre a fertilização dupla. O estudo dos mecanismos de diferenciação e maturação dos dois tipos de células que formam o grão de pólen é essencial para compreender a reprodução em plantas, reprogramação epigenética e imprinting genómico, mas até à data, este tipo de abordagens na planta modelo Arabidopsis thaliana não eram possíveis pela falta de métodos disponíveis para o isolamento das células espermáticas. Nesta tese descrevemos pela primeira vez um método que utiliza a citometria de fluxo para separar as células espermáticas e o núcleo vegetativo do pólen de Arabidopsis, o que permitiu a análise do seu transcritoma por microarrays. A análise comparativa com o transcritoma de tecidos esporofíticos permitiu concluir que a linha generativa tem um perfil de transcrição distinto e diverso, funcionalmente direcionado para a reparação do DNA, proteólise por ubiquitinação e progressão no ciclo celular. Além disso, a análise de genes associados a vias de metilação do DNA e processamento de RNAs pequenos sugere que a regulação do estado epigenético do genoma paterno pode depender de novos mecanismos até agora desconhecidos. Os transposões são silenciados por mecanismos epigenéticos através de RNAs pequenos de interferência (small interfering RNAs, siRNAs), o que é especialmente importante para os gâmetas, pois contribuem com material genético para a geração seguinte. No pólen de Arabidopsis a expressão de transposões é reativada, mas apenas no núcleo vegetativo que não contribui com o seu DNA para o zigoto. A expressão de transposões na célula vegetativa coincide com ausência de siRNAs e outros elementos essenciais para a formação da iv heterocromatina. No entanto, siRNAs de 21nt derivados de retrotransposões Athila são processados e acumulam-se no pólen e nas células espermáticas, sugerindo assim que siRNAs derivados da reativação de transposões no núcleo vegetativo podem vir a contribuir posteriormente para o seu silenciamento nos gâmetas. Para compreender os mecanismos de reprogramação epigenética durante o desenvolvimento da linha generativa no pólen de Arabidopsis, analisamos o perfil de metilação do DNA para os três tipos de núcleos que representam o desenvolvimento do gametófito masculino, desde a célula precursora (micrósporo) até ao grão de pólen maduro. Com estes resultados foi possível verificar que a célula vegetativa perde metilação CG e CHG em comparação com as células espermáticas e micrósporos, mas apenas em zonas específicas, nomeadamente transposões adjacentes a genes imprinted. Isto sugere que a metilação em CG e CHG é corretamente propagada após a meiose e durante a replicação de DNA que dá origem à linha generativa, mas posteriormente apagada apenas no núcleo vegetativo. No entanto, os níveis de metilação assimétrica CHH, que está relacionada com a metilação do DNA direcionada por RNAs (RNA-directed DNA Methylation, RdDM), são mais baixos nos núcleos das células espermáticas do que no vegetativo, o que reflete a acumulação de siRNAs correspondentes no pólen. Em transposões do tipo RC/Helitron e DNA/MuDR, existe um grupo específico que parece ser regulado por siRNAs e metilação em CHH, mantendo assim os níveis de metilação CG e CHG, e outro grupo que não apresenta siRNAs e metilação CHH, perdendo também a metilação CG e CHG. Estes resultados sugerem que a perda de metilação em zonas que não são alvos de RdDM no núcleo vegetativo, pode significar um mecanismo envolvido na reprogramação de imprinting genómico. Tanto em plantas como animais, os vários estudos sobre a importância de microRNAs (miRNAs) no desenvolvimento da linha generativa são contraditórios. A maioria das v proteínas envolvidas nas vias de produção e atividade de miRNAs é conhecida, no entanto, este conhecimento é ainda escasso no que diz respeito à possível existência de mecanismos de regulação pós-transcricional distintos entre diferentes tipos de células. Por esse motivo, procedemos à análise por sequenciação de miRNAs em células espermáticas e no pólen, utilizando diferentes ferramentas moleculares que permitiram a redução da sua atividade durante o desenvolvimento da linha generativa. Conseguimos ainda identificar 25 miRNAs potencialmente novos, assim como variações no tamanho de miRNAs anteriormente conhecidos, o que pode indicar a sua sub-funcionalização por associação com um complexo de silenciamento de genes específico da linha generativa. A proteína Argonaute 5 (AGO5) pode fazer parte desse complexo, uma vez que tem homologia com AGO1 e está localizada no citoplasma das células espermáticas. No entanto, a expressão de transcritos-alvo de miRNAs não se encontra desregulada no pólen do mutante ago5-4, indicando assim que AGO5 não está diretamente envolvido no silenciamento pós-transcricional de genes durante o desenvolvimento do pólen. Ainda assim, os nossos resultados sugerem um mecanismo anteriormente descrito para AGO10, que ao sequestrar certos miRNAs previne a sua incorporação em outras proteínas Argonaute envolvidas no silenciamento de genes ao nível pós-transcricional. Para além disso, a atividade de AGO5 durante o desenvolvimento do polén poderá estar ainda relacionada com o silenciamento de genes ao nível da transcrição, uma vez que muitos dos genes sobre-expressos no mutante são flanqueados por transposões normalmente silenciados por RdDM.
Description: Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Celular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/5880
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