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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/5903

Title: Envolvimento da ribonuclease humana Dis3L1 em processos de controlo de qualidade da expressão génica
Authors: Cruz, David João Clara da, 1986
Loison, Luísa Romão, 1963-
Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Advisor: Loison, Luísa Romão, 1963-
Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Keywords: Biolopia celular
Expressão génica
RNA mensageiro
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: A expressão génica nos eucariotas envolve um número de etapas interligadas desde a transcrição do material genético até à tradução em proteína, sendo os RNAs mensageiros (mRNAs) os intermediários chave ao longo deste processo. Embora a complexidade da expressão génica dos eucariotas permita um controlo da produção proteica a vários níveis, também torna este processo vulnerável a erros. As células eucariotas desenvolveram mecanismos elaborados de controlo de qualidade do mRNA que asseguram a fidelidade da expressão génica através da detecção e degradação de transcritos anómalos. Como exemplo destes mecanismos de controlo de qualidade temos: o NMD (Nonsense-mediated mRNA Decay), que reconhece e elimina mRNAs que contenham codões prematuros de terminação da tradução, e o NSD (Nonstop mRNA Decay) que elimina mRNAs que não possuem codões de terminação em fase na grelha de leitura. O exossoma é um complexo proteico evolutivamente conservado que possui actividade ribonucleolítica e que se encontra presente tanto no núcleo como no citoplasma das células eucariotas. Uma das várias funções do exossoma é participar na degradação de mRNAs anómalos portadores de mutações nonsense ou de mutações nonstop. Como consequência da recente identificação de uma nova ribonuclease, a hDis3L1, como parte integrante do exossoma, este trabalho teve como objectivo avaliar o envolvimento desta subunidade do exossoma humano na degradação inerente ao NMD e ao NSD. Para tal, usaram-se variantes do gene da β-globina humana: um gene portador de mutação nonsense e sensível ao mecanismo de NMD (β39, com uma mutação nonsense no codão 39), um gene sem qualquer codão de terminação em fase (βnonstop) e o correspondente gene normal (βn), como genes modelo. Estes genes clonados em vectores de expressão foram usados para transfectar transitoriamente células HeLa em cultura. Simultaneamente, foram realizados testes de RNA interference (RNAi) através da transfecção de small interference RNAs (siRNAs) específicos para o transcrito que codifica hDis3L1 e, como controlo, siRNAs para um transcrito não específico (luciferase). Nestas condições de inibição da expressão da hDis3L1 ou em condições normais, as células em cultura foram colhidas para extracção do RNA total. O nível de mRNA das globinas foi quantificado por RT-qPCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction), enquanto que o nível de inibição da expressão de cada transcrito sujeito a RNAi foi avaliado por RT-PCR (semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction). Em condições de baixa expressão de hDis3L1 na célula, pretendeu-se verificar se os transcritos β39 e βnonstop aumentam de expressão, o que indicaria que o mecanismo de NMD e/ou o mecanismo de NSD ficariam inibidos, sugerindo que a ribonuclease hDis3L1 estaria envolvida no processo de degradação de transcritos com mutações nonsense ou non-stop, respectivamente. De facto, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que a hDis3L1 participa no mecanismo de NMD, uma vez que se verificou um aumento dos níveis de transcritos nonsense aquando da inibição da hDis3L1. Por outro lado, sugerem também que a hDis3L1 não participa no mecanismo de NSD, uma vez que não se verificaram alterações nos níveis dos transcritos nonstop em condições de inibição desta subunidade do exossoma. Estes resultados contribuem assim para melhor compreender estes processos de degradação envolvidos no controlo de qualidade da expressão génica e podem contribuir para um possível desenvolvimento de ferramentas específicas para a manipulação do processo de NMD, o qual pode levar ao estabelecimento de terapias específicas direccionadas a patologias, como cancro e muitas doenças genéticas, associadas a este tipo de mutações nonsense.
Eukaryotic gene expression involves a series of interconnected steps from transcription to protein synthesis, in which mRNAs are the key mediators along this process. Even though eukaryotic gene expression complexity allows a tight control of protein production at several levels, it also makes this process vulnerable to errors that can occur along the mechanism. Eukaryotic cells have developed elaborated mechanisms of mRNA quality control that ensure genetic expression fidelity through detection and degradation of faulty transcripts. Two examples of these mRNA quality control mechanisms are the NMD (Nonsense-mediated mRNA Decay), which can recognise and degrade mRNA with premature stop codons, and the NSD (Nonstop mRNA Decay) which degrades mRNAs without any in frame termination codons. The exosome is an evolutionarily conserved protein complex that possesses a ribonucleolytic activity and that is present in the nucleus as well as in the cytoplasm of eukaryotic cells. One of the exosome’s several functions is participating in the degradation of abnormal mRNAs carrying nonsense mutations or nonstop mutations. As a result of the recent identification of a novel ribonuclease, hDis3L1, as an integrated part of the exosome, this work aimed to assess the involvement of this human exosome’s subunit involvement in the degradation intrinsic to NMD and to NSD. In order to achieve that, several variants of the human β-globin gene were used: a gene carrying a nonsense mutation (β39, with a nonsense mutation at codon 39), a gene without any in frame termination codons (βnonstop) and the respective wild-type gene (βn), as reporter genes. These genes which were cloned on expression vectors were used to transiently transfect HeLa cells in culture. Simultaneously, small interference RNAs (siRNAs) specific for the transcript coding the hDis3L1 and siRNAs for a non-specific transcript (luciferase), as a control, were also transiently transfected. For these conditions of expression inhibition of hDis3L1 or in normal conditions, cells in culture were harvested to extract total RNA. The globin mRNA levels were quantified by RT-qPCR (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction), while the inhibition of expression of each of the proteins subjected to RNAi was evaluated through RT-PCR (semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction). At hDis3L1 low expression conditions, it was assessed if NMD or NSD would be inhibited, suggesting that ribonuclease hDis3L1 would be involved in the degradation mechanism of transcripts carrying nonsense or nonstop mutations, respectively. In fact, the results obtained in this work suggest that hDis3L1 takes part in NMD, since an increase in nonsense transcript levels was seen when the hDis3L1 subunit is inhibited. Our results also suggest that hDis3L1 does not take part in NSD, since changes in nonstop transcript levels were not observed when this subunit was inhibited compared to normal conditions. These results contribute therefore for a better understanding of these mechanisms of mRNA degradation involved in gene expression quality control. Also, they provide aid for a possible future development of specific tools for NMD manipulation, which present a promising role in the establishment of specific therapies directed to pathologies, like cancer and many genetic diseases, associated to nonsense mutations.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/5903
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