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Title: Role of adenosine A2A receptors in the neuroprotective effect of corticotrophin releasing hormone (CRH)
Authors: Valadas, Jorge Miguel de Sousa
Advisor: Lopes, Luísa Maria Vaqueiro, 1975-
Lima, Pedro A.
Keywords: Adenosine
A2A receptors
Corticotrophin Releasing Factor (CRF)
CRF1R
CRF2R
Neuroprotection
Teses de mestrado - 2010
Issue Date: 2010
Abstract: O factor de libertação da corticotrofina (corticotrophin releasing factor, CRF) é um componente essencial na regulação do stresse. No eixo hipotálamo-hipofisário (hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA) é libertado do hipotálamo, activando os receptores de subtipo CRF1R e CRF2R, que regulam a libertação de corticotrofina pela hipófise. Esta, por sua vez, induz a libertação de glucocorticóides das glândulas supra-renais. Findo o período de stresse, os glucocorticóides regulam negativamente a libertação de CRF e diminuem a activação do eixo HPA, restabelecendo a homeostasia inicial do sistema. Recentemente, para além da sua acção no eixo HPA, a presença dos receptores de CRF foi observada em neurónios provenientes de outras áreas cerebrais como o córtex ou o hipocampo. O CRF tem funções neuroprotectoras perante vários tipos de insulto, como a excitotoxicidade induzida por glutamato, a agregação da proteína β-amilóide ou a indução de stress oxidativo. Curiosamente, a adenosina, um neuromodulador, exerce o mesmo tipo de função neuroprotectora em áreas cerebrais semelhantes, por activação dos seus receptores. Enquanto a activação dos receptores de adenosina de subtipo A1 (A1R) induz um decréscimo da excitabilidade neuronal, a activação dos receptores de subtipo A2A (A2AR), na generalidade, aumenta-a. Estes receptores possuem grande afinidade para a adenosina e estão presentes na maioria das áreas cerebrais, embora com diferentes níveis de expressão. Assim, para modular a excitabilidade neuronal existem estratégias farmacológicas que consistem quer na activação dos A1R quer no bloqueio dos A2AR. No entanto, a última abordagem tem sido recentemente mais investigada e é largamente usada na prevenção de morte celular tanto em modelos in vitro como in vivo. Em situações de isquémia, observa-se tanto um aumento dos níveis de CRF como de adenosina no cérebro de rato. Este aumento sugere uma acção relevante destes mediadores quer na manutenção da viabilidade neuronal quer na regulação da expressão de diversos genes importantes para o desenvolvimento e diferenciação neuronal. Por outro lado, sugere uma possível interacção entre os receptores do CRF e da adenosina. Esta hipótese tornou-se ainda mais provável após a observação, no nosso laboratório, que a administração oral de antagonistas dos receptores A2A reverte os efeitos do stresse no hipocampo, induzidos por separação maternal em ratos. Esta reversão pode ser consequência de regulação dos constituintes do eixo HPA, como os glucocorticóides ou o CRF. Adicionalmente, as vias de sinalização intracelular activadas pela acção do CRF (através dos receptores CRF1R e CRF2R) e da adenosina (através dos A2AR) são semelhantes. Envolvem activação de proteínas Gs com consequente aumento de actividade de cinases de proteínas, como a cinase A (PKA), a cinase C (PKC) e a mitogen-activated protein kinase (MAPK). O objectivo deste trabalho foi estudar a acção do CRF na viabilidade celular em condições de excitoxicidade induzida por glutamato e avaliar a possível interacção com os receptores de adenosina do subtipo A2A. Foram usadas culturas primárias de neurónios de córtex de embriões de rato com 18 dias de gestação. Ao oitavo dia, as culturas foram tratadas durante 24 horas com glutamato, nas concentrações de 20 a 1000 μM, em condições de bloqueio ou activação dos receptores A2A e do CRF, através da aplicação de agonistas e antagonistas dos respectivos receptores. O glutamato é um aminoácido excitatório e um dos responsáveis pela excitotoxicidade induzida por eventos isquémicos no sistema nervoso central. Ao actuar nos receptores ionotropicos de glutamato induz a entrada de cálcio e sódio extracelulares assim como a libertação de cálcio do reticulo endoplasmático. O aumento de cálcio e sódio intracelulares, pode levar à morte celular quer por apoptose quer por necrose. A técnica de marcação simultânea com as sondas nucleares iodeto de propidio (PI) e Syto-13 foi usada com o objectivo de caracterizar a viabilidade celular nas diferentes condições. Inicialmente, foi investigada a concentração de glutamato (de 20 a 1000 μM) a ser aplicada às células em cultura com o objectivo de reproduzir as consequências de um insulto neuronal in vivo. Simultaneamente aos ensaios de viabilidade celular, foram determinados os níveis de um mediador de morte por apoptose, a caspase-3, pela técnica de Western blotting. Este insulto provocou um decréscimo na viabilidade celular que é dependente da concentração de glutamato usada, sendo superior para concentrações mais altas. Por seu lado, a activação da via apoptótica ocorre preferencialmente para baixas concentrações de glutamato (até 50 μM). Para o desenvolvimento do restante trabalho a concentração seleccionada foi a de 100 μM, que causou uma diminuição para 76,4±1,63% (n=4) da viabilidade celular, visto originar tanto morte por apoptose como por necrose neste modelo. A função neuroprotectora do CRF na gama de concentrações de glutamato anteriormente descrita foi observada através da aplicação de urocortina (10 pM), um composto da família do CRF com semelhante afinidade para os dois receptores de CRF. Embora a urocortina aparente ter funções protectoras em todas as concentrações de glutamato usadas, o aumento mais significativo na viabilidade neuronal foi observado na presen- ça de glutamato 100 μM (de 76,4±1,63% para 90,5±2,23%, P<0,001, n=3). Esta variação na sobrevivência neuronal, perante um insulto neurotóxico, não apresenta o mesmo padrão nos níveis de caspase-3. Para baixas concentrações de glutamato a urocortina aumenta os níveis de caspase-3, enquanto para concentrações de glutamato elevadas, os níveis deste marcador apoptótico parecem diminuir. Esta proteína, característica da indução de morte celular por apoptose exclui o dano causado por necrose. Durante esta primeira etapa do trabalho conclui-se que a urocortina exerce funções protectoras sobretudo na prevenção do processo necrótico induzido pelo glutamato. Numa etapa seguinte foram diferenciados os efeitos dos dois tipos de receptores do CRF na neuroprotecção. Assim, usando dois antagonistas selectivos, antalarmina (10nM) para CRF1R e anti-Sauvagina-30 (10nM) para CRF2R, foi observado que o bloqueio de cada um dos receptores de forma independente leva à perda da função da urocortina (73,9±3,53% bloqueando os CRF1R, P<0,01 n=4, e 76,0±2,80% ao bloquear os CRF2R, P<0,01, n=4). Conclui-se que a activação simultânea dos dois receptores pela urocortina é necessária para que ela exerça o seu efeito neuroprotector perante um insulto de glutamato (100 μM). Durante este processo de bloqueio dos receptores de CRF, observou-se uma interacção directa entre os dois fármacos usados, antalarmina e anti-Sauvagina-30, que os impede de bloquear eficientemente os receptores de CRF, quando usados em simultâneo. Esta interacção foi avaliada através de técnicas de fluorescência que permitem observar a diminuição do sinal produzido pelo aminoácido fenilalanina, presente na anti-Sauvagina-30, com a adição de concentrações crescentes de antalarmina. Assim, quando introduzidos simultaneamente no meio celular, são ineficazes a bloquear o efeito da urocortina. Após a observação da função da urocortina na protecção da morte celular induzida por glutamato, estudou-se a modulação exercida pelos A2AR nesse efeito. Confirmou-se que o bloqueio dos A2AR, através do antagonista SCH 58261 (50 nM) é neuroprotector. Por outro lado, a activação deste subtipo de receptores está descrita como nociva para este tipo de células. Contudo, a activação directa destes receptores pelo agonista selectivo, CGS 21680 (30nM), não alterou a viabilidade celular, provavelmente devido à elevada concentração de adenosina no meio extracelular. A modulação simultânea dos receptores A2A e de CRF revelou a existência de uma interacção entre os mesmos. A neuroprotecção conferida pelo bloqueio dos A2AR é dependente da activação dos receptores de CRF do tipo 2 mas independente dos do tipo 1, facto que foi observado pelo bloqueio selectivo dos receptores de CRF em condições de antagonismo dos A2AR. A protecção concedida pelo antagonista SCH 58261 é suprimida quando os CRF2R se encontram bloqueados (de 88,3±1,53% para 74,8±4,91%, P<0,01, n=5) revelando-se independente do bloqueio dos CRF1R (87,7±3,48%, n=4). Simultaneamente, em células PC12 diferenciadas com Nerve Growth Factor (NGF), observou-se a modulação dos níveis dos A2AR pelos seus ligandos. A activação dos A2AR diminui os seus níveis (48,9±5,5%, P<0,001, n=4), enquanto o bloqueio os aumenta (144±15,2%, P<0,01, n=5). Os ligandos dos receptores de CRF não alteram os níveis dos A2AR em condições basais. Porém, quando aplicados em simultâneo com os ligandos dos A2AR o mesmo não se observa. Concretamente, ocorre uma redução nos níveis dos A2AR na presença do seu antagonista quando os receptores CRF1R se encontram bloqueados e os CRF2R activados (39,4±14,4% do controlo, P<0,01, n=4). Em suma, este trabalho permitiu observar a função neuroprotectora dos receptores do CRF em neurónios em cultura perante um insulto de glutamato, quer pela acção directa nos seus receptores quer pela modulação dos receptores de adenosina do subtipo A2A. O modelo usado permite diferenciar as alterações na viabilidade das células em cultura por duas vias de promoção da morte celular, apoptose e necrose, respectivamente para baixas e elevadas concentrações de glutamato. A neuroprotecção conferida pelo CRF ocorre sobretudo na prevenção da morte celular por necrose e é dependente da activação simultânea dos dois tipos de receptores, CRF1R e CRF2R. Para além dos efeitos directos através dos seus receptores, o CRF exerce uma modulação dos A2AR. Estes receptores apresentam expressão diminuída em condições de activação dos CRF2R e bloqueio dos A2AR. Este fenómeno de regulação dos A2AR por parte dos CRF2R constitui uma alternativa à protecção por CRF atrás descrita. Novas abordagens terapêuticas, que incluam a modulação destes dois tipos de receptores podem ser futuramente testadas com o objectivo de diminuir a morte neuronal provocada por insultos excitotóxicos em eventos isquémicos.
In hypoxia, glutamate excitotoxicity induces neuronal death. Simultaneously, adenosine is released and is accompanied by an increase of the stress mediator, corticotrophinreleasing factor (CRF). In vivo modulation of adenosine A2A receptors (A2AR) reverses hippocampal stress-induced effects. This raises the question whether A2AR regulate CRF actions. We now evaluated the interaction between the blockade of A2AR and the activation of CRF receptors (CRFR), upon glutamate insult. Primary rat cortical neuronal cultures (9 days in vitro) were challenged with glutamate (20-1000μM, 24 hours). The effects of the CRFR and A2AR ligands on cell viability were measured using propidium iodide and Syto-13 fluorescence staining. Pro-caspase-3 fragmentation was used as an apoptotic marker. A2AR levels were quantified in NGFdifferentiated PC12 cells by Western blotting. Glutamate decreased cell viability in a concentration-dependent manner. At 100 μM we observed a reduction of viability to 76.4±1.63% of control (P<0.001, n=6). Urocortin (10pM), a CRFR agonist, increased cell survival to 90.5±2.23% (P<0.001 compared to glutamate, n=3). This effect was abolished by blocking either CRF1R or CRF2R with antalarmin (10nM) or anti-Sauvagine-30 (10nM), respectively. Activation of A2AR did not affect cell death induced by glutamate. However, A2AR blockade with a selective antagonist SCH 58261 (50nM) improved cell viability against the glutamate insult. This effect was dependent on CRF2R but not on CRF1R activation. The A2AR levels measured in PC12 cells were modulated by CRF2R. The A2AR upregulation induced by SCH 58261 (144±15.2%, P<0.01 n=5; 50 nM) was abolished by CRF2R (P<0.01, n=4) but not by CRF1R activation. Overall these data show a protective role of CRF in cortical neurons, against glutamateinduced death, either directly by CRFR activation or by modulating A2AR actions. The neuroprotection achieved by A2AR blockade requires CRF2R activation, which might result from CRF2R modulation of A2AR levels. The interaction between these receptors may point toward novel pharmacological approaches based on common molecular pathways.
Description: Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10451/5938
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