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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/5942

Title: Quantitative analysis of Bicyclus anynana's eyespot wing pattern images
Authors: Lopes, Pedro dos Santos, 1982-
Advisor: Alves, Filipa
Martins, Gabriel G.
Keywords: Bioinformática
Padrões de eyespot
Bicyclus anynana
Microscopia de fluorescência
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: The main objective of this work is to provide researchers with a tool to quantitatively analyse images of the eyespot patterns present in the wings of the butterfly species Bicyclus anynana. More specifically, this tool is a plugin for imageJ, a free open-sourced image processing program. Until now, researchers have been using software such as imageJ to quantify some dimensions of these patterns through manual measurements. This plugin offers an effective, quick and automatic way to obtain these measurements and others more difficult to get until now, such as the area of each coloured region. It also offers the possibility to obtain representative images of the eyespot(s). Besides images with a single eyespot, the program also analyses wing images with several eyespots as well as fluorescence microscopy images with specific proteins labelled. In the first two types, the program finds the eyespots automatically and analyses them individually, and in the latter ones, the program can provide us with intensity plots of transversal cuts through the middle of the eyespot. To obtain the required data, the plugin finds the centre of each eyes pot and, from there, searches for the frontiers of each of its coloured areas. It then calculates their area, diameter and roundness which will be used to calculate the rest of the needed data and to create the representative images. In case of fluorescence microscopy images, the program unites its coloured dots through a dilation process and then acquires the intensity plots. In the end, we have a program that gives more and better data to help future research on evolution and development using this species and that could subsequently be transformed into a more generic plugin capable of analysing any pattern containing closed frontiers due to its strong aptitude to obtain these, regardless of any possible background noise.
Este trabalho tem como objectivo proporcionar aos investigadores uma ferramenta para análise quantitativa de padrões eyespot em imagens de asas de borboletas Bicyclus anynana, nomeadamente um plugin para o imageJ, um programa de análise de imagem gratuito open source. Até então tem-se recorrido ao uso de softwares como o imageJ para obter algumas dimensões destes padrões através de medidores manuais de distâncias que se encontram disponíveis nos ditos softwares. Este plugin oferece um modo rápido e eficaz de obter essas medições de distâncias e outras que até então não eram possíveis de serem obtidas por métodos manuais, como a área de cada região do eyespot e a circularidade (roundness) do mesmo. O plugin também oferece a possibilidade da criação automática de imagens representativas do eyespot em análise, quer usando as fronteiras reais de cada área quer usando representações elípticas das mesmas. Para além de imagens com um eyespot individual, o programa também analisa imagens de asas com vários eyespots bem como imagens de microscopia de fluorescência mostrando expressão da proteina Distal-Iess ou Engrailed. Para os primeiros tipos de imagem, o programa encontra automaticamente os eyespots e analisa-os individualmente, e para os últimos o programa possibilita o retorno de cortes transversais, passando pelo meio do eyespot, através de gráficos de intensidades, que auxiliam o investigador na sua análise. A espécie Bicyclus anynana tem eyespots anterior e posterior nas superficies ventral e dorsal das asas dianteiras e vários eyespots na superficie dorsal das asas traseiras. Estes padrões são circulares e são de diferentes tamanhos e têm a mesma constituição: uma pequena área branca no centro com aproximadamente um centésimo do tamanho do eyespot, uma área preta predominante e uma faixa amarela em torno desta, envolvendo o eyespot. Estes aspectos morfológicos têm uma grande variação genética e todos eles mostraram que reagem em conjunto à selecção artificial e até mesmo a mutações. Esta aparente união é devido a partilharem o mesmo tipo de desenvolvimento, a partir de centros organizadores denominados por foei, sendo também observado uma expressão de genes de desenvolvimento característica em préadultos. No entanto, um grande potencial para variação independente do tamanho do eyespot tem-se observado. Para estudar mais a fundo estas variações neste tipo de padrão, é preciso obter-se dados de aspecto mais quantitativo para se ter uma correspondência mais precisa e significativa entre a expressão genética e a variação fenotípica que se observa no indivíduo adulto. Para a obtenção dos dados pretendidos, o plugin, para imagens de eyespots individuais ou imagens de uma asa, obtém o centro do(s) eyespot(s) e, a partir dele, procura as três fronteiras que o constituem. Ao encontrar cada fronteira, o programa regista essas fronteiras individuais e utiliza-as para obter informações como as áreas, diâmetros e circularidade que depois servem para os cálculos pretendidos de proporções entre áreas ou criação das imagens representativas. Para a obtenção destas fronteiras, o programa binariza a imagem, onde depois é aplicada a função outline e skeletonize, obtendo-se assim linhas de um pixel de largura. Depois o programa segue por cada uma delas num determinado sentido e percorre-as somente pelo caminho mais curto, sem se enganar por possíveis erros presentes na imagem. Para saber qual o caminho a seguir, o programa pinta cada lado de cada linha com uma determinada cor e, para ser a linha correcta, esta tem de ter pelo menos um pixel de cada uma destas cores presente na sua vizinhança. Existem casos especiais que podem ocorrer, como haver mais que um pixel para seguir que contenha as condições certas ou o lado exterior não ter sido completamente pintado para poder seguir em frente, por exemplo. Para estes casos e outros, existem outro tipo de subregras que depois são aplicadas, de modo a possibilitar ao programa seguir em frente e continuar pelo caminho certo. São estas correcções e subregras que fazem com que o plugin seja relativamente robusto em relação a possíveis indefinições existentes na própria imagem. No caso de imagens de uma asa, para se obter dados correctos e individuais para cada eyespot, o programa tem de os separar, e fá-lo traçando rectas entre eles, de modo a que quando o programa obtém a última fronteira, a exterior, o programa não siga para o eyespot vizinho e o contabilize para os dados do eyespot a ser analisado. Ao finalizar a análise de cada um dos eyespots, o programa volta a pintar o que coloriu com as cores originais, branco para as áreas e preto para as fronteiras, de modo a não ocorrer erros com a análise do eyespot anterior. No caso de imagens de microscopia de fluorescência, sendo esta constituída por pontos coloridos num fundo preto que correspondem à expressão de uma determinada proteína, o programa une esses pontos através de um processo de dilatação para dar volume ao eyespot e proceder então aos cortes transversais pretendidos pelo utilizador. Um dos tipos de cortes possíveis é um corte médio que corresponde a uma média de vários cortes ao longo do eyespot em diferentes ângulos. Para tal o programa cria uma imagem que é a média entre várias imagens, cada uma delas com uma determinada rotação em relação à anterior com centro no meio da região central do eyespot. O programa também possibilita a obtenção de outros dados como a área, o diâmetro e a circularidade (roundness) para cada região. Como resultado final tem-se um programa que analisa quantitativamente os padrões eyespot presente nas asas de borboleta da espécie Bicyclus anynana, que nos possibilita ter uma conecção mais fidedigna entre o padrão observado e a expressão genética envolvente na sua formação, obtendo-se assim mais e melhores dados de análise para futuros trabalhos de investigação em evolução e desenvolvimento usando esta espécie. Posteriormente, este plugin pode ser transformado num mais genérico, capaz de analisar qualquer padrão constituido por fronteiras circulares fechadas, devido à sua forte capacidade de obtenção deste tipo de fronteiras apesar de qualquer possível ruido de fundo na imagem.
Description: Tese de mestrado. Bioinformática e Biologia Computacional. Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/5942
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