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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/6198

Título: The role of mRNA translation on nonsense-mediated decay inhibition of transcripts carrying a short open reading frame
Autor: Peixeiro, Isabel Cristina Ramos, 1982-
Orientador: Loison, Luísa Romão, 1963-
Amaral, Margarida, 1958-
Palavras-chave: RNA mensageiro
β-globina humana
Genética molecular
Teses de doutoramento - 2012
Issue Date: 2011
Resumo: Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a surveillance pathway that recognizes and rapidly degrades mRNAs containing premature termination codons (PTC). The unified model for NMD, proposes that the decision of NMD triggering is the outcome of the competition between the cytoplasmatic poly(A)-binding protein 1 (PABPC1) and the NMD effector UPF1 for the termination complex. Consequently, PTCs located far, in a linear sense, from the poly(A) tail and associated PABPC1 in mRNAs containing residual downstream exon junction complexes (EJCs) are expected to elicit NMD. Nevertheless, it has been reported that mRNAs containing PTCs in close proximity to the translation initiation codon (AUG-proximal PTCs) can substantially evade NMD. The work described in this thesis was focused on the mechanistic basis for this NMD resistance, exemplified by human β-globin transcripts carrying an AUG-proximal PTC. We demonstrated that translation termination at an AUG-proximal PTC lacks the ribosome stalling that is evident in an NMD-sensitive PTC. In fact, we have shown that the establishment of an efficient translation termination reaction at the AUG-proximal PTC is dependent on PABPC1 interaction with the initiation factor eIF4G and with the release factor eRF3 at the terminating ribosome. These interactions underlie critical 3’-5’ linkage of translation initiation with efficient termination at the AUG-proximal PTC and contribute to an NMD-resistant PTC definition at an early phase of translation elongation. Furthermore, we provide strong evidence that the eukaryotic initiation factor 3 is involved in delivering eIF4G-associated PABPC1 into the vicinity of the AUG-proximal PTC through eIF3h and eIF3f subunits. These data support the “AUG-proximity effect” as a major inhibitor of the NMD pathway. The work presented here corroborates a role for PABPC1 on NMD evasion of AUG-proximal transcripts and provides further insights into the mechanistic details of PTC definition and translation initiation.
O mecanismo de decaimento do mRNA mediado por mutações nonsense, ou nonsense-mediated mRNA decay (NMD), é um processo de controlo de qualidade da expressão génica que permite a eliminação de transcritos portadores de codões de terminação da tradução prematura (CTPs). A eliminação dos transcritos anómalos permite reduzir a produção de proteínas truncadas, protegendo a célula dos efeitos dominantes negativos resultantes da acumulação de péptidos potencialmente tóxicos (Behm-Ansmant & Izaurralde, 2006; Chang et al, 2007). Este mecanismo desempenha não só uma função como modulador de doenças genéticas, mas também uma importante função na regulação de transcritos fisiológicos envolvidos em vários processos celulares (McGlincy et al, 2010; Mendell et al, 2004; Rehwinkel et al, 2006). Nos mamíferos, durante o processo de splicing, é depositado um complexo proteico, cerca de 20-24 nucleótidos (nt) a montante de cada junção exão-exão, designado complexo junção exão-exão (exon junction complex – EJC) (Le Hir et al, 2001). Estes complexos permanecem associados ao mRNA durante o seu transporte para o citoplasma e são removidos pelo ribossoma durante a primeira ronda de tradução (Ishigaki et al, 2001; Lejeune et al, 2002; Maquat, 2004). Assim, admite-se que, no caso de existir um CTP situado a 50-55 nt a montante da última junção exão-exão, o transcrito permanecerá associado a pelo menos um EJC, que poderá induzir a activação do mecanismo de NMD. A relação entre os EJCs e o NMD é mediada por três factores UPF1, UPF2 e UPF3, considerados os principais efetores do processo de NMD. A interacção das proteínas UPF2 e UPF3, componentes do EJC, com a proteína UPF1, que é recrutada para o complexo de terminação pelos factores de terminação da tradução eRF1 e eRF3, resulta na activação do mecanismo de NMD (Kashima et al, 2006; Le Hir et al, 2001). Por outro lado, quando o codão de terminação se localiza depois da última junção exão-exão, o ribossoma atinge o codão de terminação depois de remover todos os EJCs, que não poderão, assim, desencadear a degradação do transcrito (Maquat, 2004). No decorrer do últimos anos, vários estudos têm vindo a evidenciar o envolvimento da proteína citoplasmática 1 de ligação à cauda poli(A), PABPC1, no processo de discriminação entre codões de terminação normais e prematuros. A proteína PABPC1 compete com a UPF1 pela interacção com o complexo de terminação e estimula a eficiência da terminação da tradução. De facto, existem evidências experimentais de que a proximidade da PABPC1 ao codão de terminação é suficiente para inibir o mecanismo de NMD, mesmo na presença de um EJC a jusante (Eberle et al, 2008; Ivanov et al, 2008; Silva et al, 2008; Singh et al, 2008). Desta forma, quanto maior a distância entre o codão de terminação prematuro e a cauda poli(A), maior será a probabilidade de desencadear o NMD, e a presença de um EJC a jusante poderá funcionar como um potenciador da degradação do transcrito (Stalder & Muhlemann, 2008). De acordo com este modelo, a localização de um codão de terminação prematuro na proximidade do codão de iniciação (AUG) será suficiente para activar o NMD. No entanto, verificou-se que os transcritos da β-globina humana portadores de CTPs no início do primeiro exão constituem uma excepção a esta regra, uma vez que apresentam uma estabilidade semelhante à do transcrito normal (Romao et al, 2000). A análise funcional destes transcritos permitiu concluir que a resistência ao mecanismo de NMD não é uma consequência da ocorrência de re-iniciação da tradução e é independente quer da identidade do transcrito quer do contexto da sequência (Inacio et al, 2004; Silva et al, 2006). De facto, estudos anteriores indicam que a proximidade do codão de terminação ao AUG é o principal determinante na inibição do NMD (Silva et al, 2006; Silva et al, 2008). Com o objectivo de compreender o mecanismo molecular subjacente ao efeito da proximidade do CTP ao AUG foi proposto um modelo que postula que a PABPC1, por se encontrar na vizinhança do AUG iniciador durante o processo de tradução de uma grelha de leitura curta, poderá estar implicada na resistência ao NMD dos transcritos portadores de um CTP próximo do codão de iniciação (Silva et al, 2008; Silva & Romao, 2009). Este modelo baseia-se na capacidade da PABPC1 interagir com a cauda poli(A), na extremidade 3’ do mRNA, e em simultâneo com o factor de iniciação eIF4G, associado à extremidade 5’ do transcrito. Esta interacção entre as duas extremidades dos mRNAs durante a tradução resulta na aquisição de uma conformação circular (Wells et al, 1998). As evidências experimentais que indicam que alguns dos factores de iniciação da tradução envolvidos no processo de scanning permanecem associados ao ribossoma durante os primeiros passos do alongamento da tradução (Poyry et al, 2004) levaram-nos a sugerir que a PABPC1 poderia ser trazida para a vizinhança do AUG em associação com o complexo de iniciação. Assim, no caso de um evento de terminação demasiadamente prematuro, a PABPC1 manter-se-ia numa posição favorável para interagir com o complexo de terminação e estimular a eficiência da terminação da tradução, com a consequente supressão do NMD (Silva & Romao, 2009). O trabalho apresentado nesta dissertação focou-se na identificação dos determinantes da resistência ao NMD de transcritos portadores de um CTP na proximidade do AUG, contribuindo, assim, para a compreensão do mecanismo de discriminação de um codão prematuro e do mecanismo geral da tradução. Com o objectivo de confirmar o papel da PABPC1 na inibição do NMD de transcritos portadores de um CTP localizado na proximidade do codão de iniciação, analisámos o efeito da ausência da interacção PABPC1-eRF3 na estabilidade destes transcritos. Mediante a inibição específica da expressão da proteína PABPC1 endógena por interferência de RNA e expressão de uma proteína mutante PABPC1 com uma deleção na região C-terminal (domínio responsável pela interacção com eRF3), observámos uma desestabilização dos mRNAs portadores de CTP na proximidade do AUG. Este resultado foi corroborado pela análise da estabilidade destes transcritos em condições de inibição da expressão da eRF3 endógena e expressão de uma proteína mutante eRF3 sem a região de interacção com PABPC1 (domínio N-terminal). Estes resultados sugerem que, à semelhança do que acontece nos casos de codões de terminação na parte 3’ do último exão, quando o CTP se encontra posicionado na vizinhança do AUG, a PABPC1 interage com o complexo de terminação, impedindo a interacção deste complexo com a UPF1, com a consequente inibição do NMD. Adicionalmente, demonstrámos que a resistência ao NMD dos transcritos portadores de um CTP próximo ao AUG pode ser reduzida pela inibição da interacção entre a PABPC1 e o factor do complexo de iniciação eIF4G resultante da sobreexpressão da proteína PAIP2. De facto, foi possível reverter o efeito destabilizador da sobreexpressão desta proteína mediante a inibição da expressão da UPF1, o principal mediador do mecanismo de NMD. O factor de iniciação da tradução eIF3 é um complexo multiproteico que interage com o ribossoma e a proteína eIF4G, funcionando como um elo de ligação entre os dois durante o processo de scanning (Hinnebusch, 2006; LeFebvre et al, 2006). O facto deste complexo ter a capacidade de se manter associado ao ribossoma durante os primeiros passos de elongação (Pestova, 2007) levou-nos a questionar se algumas subunidades do eIF3 poderiam estar envolvidas no posicionamento da PABPC1 na vizinhança do CTP próximo do AUG. Os nossos resultados demonstraram não só que as subunidades eIF3F e eIF3h são essências para a interacção do complexo eIF3 com o factor eIF4G e o ribossoma, respetivamente, mas também para a supressão do NMD de transcritos portadores de um CTP na proximidade do codão de iniciação. Por outro lado, uma vez que existem evidências experimentais em plantas que demonstram que a subunidade eIF3h é essencial para a re-iniciação da tradução num codão AUG a jusante do codão de terminação de pequenas grelhas de leitura a jusante (upstream open reading frame – uORF) da ORF principal; a destabilização dos transcritos em estudo em células com uma expressão reduzida da eIF3h poderia ser um resultado da incapacidade do ribossoma re-iniciar a tradução num AUG a jusante do CTP. No entanto, o estudo do efeito da eIF3h na re-iniciação da tradução após a tradução da uORF da eritropoietina humana demonstrou que a eficiência da re-iniciação da tradução não é afectada em condições de inibição da expressão da eIF3h. Em resumo, o trabalho desenvolvido nesta dissertação contribuiu para a elucidação da base molecular subjacente ao efeito da proximidade do AUG na inibição do NMD de transcritos portadores de um CTP próximo ao codão de iniciação. Os resultados obtidos demonstram que esta resistência é dependente da interacção da PABPC1 com o complexo de iniciação da tradução, através do eIF4G e das subunidades eIF3f e eIF3h, que, no caso de um CTP localizado na proximidade do AUG iniciador, posiciona a PABPC1 numa situação favorável para interagir com o complexo de terminação, através do factor de terminação eRF3, com a consequente supressão do NMD. Deste modo, o trabalho aqui apresentado, que inclui resultados já publicados num artigo científico e outros que serão submetidos em breve para publicação, contribui para a caracterização dos determinantes da discriminação de um codão prematuro e activação/inibição do mecanismo de NMD. A elucidação da função de factores de iniciação da tradução no efeito supressor de NMD resultante da proximidade do AUG ao CTP contribui também para a compreensão de conceitos da tradução, nomeadamente para o caso de pequenas grelhas de leitura.
Descrição: Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/6198
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