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Title: Validação funcional de quimeras LEXAdbdGIM em Saccharomyces cerevisiae
Authors: Amorim, Ana Fátima Gouveia Teixeira de, 1987-
Advisor: Fernandes, Lisete Celestina Perpétua, 1968-
Duarte, Júlio António Bargão, 1957-
Keywords: Transcrição genética
Citoesqueleto
Saccharomyces cerevisiae
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: O complexo GimC/Prefoldina é um complexo hetero-oligomérico envolvido na biogénese do citoesqueleto. Este complexo é constituído por seis subunidades distintas que se classificam em classe α (Gim2/Pfd3 e Gim5/Pfd5) e β (Gim1/Pfd6, Gim3/Pfd4, Gim4/Pfd2 e Gim6/Pfd1). GimC/Prefoldina interage com polipéptidos nascentes de actina e tubulina ainda ligados ao ribossoma e entrega-os à chaperonina CCT/TriC. Sabe-se que as diferentes subunidades Gim não são redundantes. A ausência de cada uma das subunidades leva a fenótipos distintos, nomeadamente, em condições de stresse oxidativo e osmótico em Saccharomyces cerevisiae. De acordo com o trabalho desenvolvido anteriormente no laboratório não foi possível correlacionar os fenótipos de stresse com defeitos a nível do citoesqueleto tendo-se equacionado se as diferenças fenotípicas poderiam estar relacionadas com a expressão genética de diferentes genes que actuam conforme as condições do meio. Atendendo ainda a dados da literatura, perspectiva-se o envolvimento das Gim, por exemplo, na regulação da transcrição. Tendo como finalidade a identificação de alvos moleculares de interacção directa com as Gim e subjacentes aos fenótipos de stresse, pretendeu-se com o presente trabalho a validação funcional das proteínas Gim em Saccharomyces cerevisiae, para utilização em sistemas two-hybrid. Para tal, foram realizados ensaios one-hybrid com quimeras LexADBDGim (Lexgim) e diferentes repórteres. Paralelamente foi averiguado o potencial de cada Gim na regulação da transcrição mediada pela RNA polimerase II. Os resultados obtidos conduziram à identificação de promotores específicos nos quais as quimeras Lexgim não desempenham funções como activadores nem como repressores transcricionais, por si só, em condições de crescimento óptimas. Deste modo, as Lexgim poderão ser utilizadas para identificação de novos alvos de interacção, em ensaios two-hybrid nas condições testadas, ou seja na ausência de stresse. Porém, dado que a interacção Gim/alvo poderá existir apenas em condições de stresse, a capacidade das Lexgim afectarem a transcrição deverá ser estudada em condições de stresse oxidativo e osmótico, através de ensaios one-hybrid.
GimC/Prefoldin is a hetero-oligomeric complex involved in cytoskeleton biogenesis. It is composed by six different subunits belonging to α (Gim2/Pfd3 and Gim5/Pfd5) and β (Gim1/Pfd6, Gim3/Pfd4, Gim4/Pfd2 and Gim6/Pfd1) classes. This complex interacts with actin and tubulin nascent polypeptides while associated with ribossome and deliver them to chaperonin CCT/TriC. The Gim subunits are not redundant. In Saccharomyces cerevisiae, the absence of each subunit leads to different phenotypes, for instance, in the presence of osmotic and oxidative stress agents. Taking into account previous work developed in our laboratory, it was not possible to correlate the stress phenotypes with cytoskeleton defects so, it was hypothesized that the phenotypic differences could be due to differential expression of specific stress genes. In addition, literature data does not exclude the involvement of the Gim, for example, in transcriptional regulation. In order to identify targets that directly interact with Gim and support the stress phenotypes, this work aimed the functional validation of Gim in Saccharomyces cerevisiae, in the context of two-hybrid systems. In this way, one-hybrid assays with each LexADBDGim (Lexgim) chimeras and different reporters were performed. At the same time it was determined the potential of each Gim to regulate transcription mediated by RNA polymerase II. The obtained results led to the identification of specific promoters in which Lexgim chimeras do not operate as transcriptional activators neither repressors per se under optimal growth conditions. In this way Lexgim can be used for two-hybrid assays within the tested conditions. Since the Gim/target interactions may occur only in stress conditions, the Lexgim capacity to affect transcription should be evaluated in osmotic and oxidative stress conditions through one-hybrid assays.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/6225
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