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Título: Protein engineering of xynalase XYN10C from Paenibacillus barcinonensis
Autor: Campos, André Nunes, 1989-
Orientador: Pastor, Javier Francisco
Carolino, M. Manuela, 1954-
Palavras-chave: Biotecnologia
Enzimas
Xilanos
Paenibacillus barcinonensis
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Resumo: Paenibacillus barcinonensis Xyn10C is a modular xylanase composed of an N-terminal tandem CBM22 module, a catalytic domain belonging to GH10 and a C-terminal tandem CBM9 module. The enzyme was previously cloned and a preliminary characterization was performed. In our work several truncated enzymes, containing different combinations of the modules of the xylanase have been constructed, purified and characterized. The activity assays here performed show that the complete enzyme (wild type Xyn10C) and a truncated variant containing only the GH10 catalytic domain are highly active on arabinoxylans, commonly found in cereal hemicelluloses, while show lower activity on glucuronoxylans, typical of hardwood species. Additionally, the diminished activity of the isolated GH10 domain on some arabinoxylans indicate that the CBM22 and CBM9 ancillary tandem domains play a role for the degradation these substrates, probably facilitating hydrolysis to the less accessible insoluble fraction of arabixoxylans. This is strongly supported by the fact that P. barcinonensis was isolated from a rice field. The microcrystalline binding capacity of Xyn10C was also investigated. The results here obtained indicate that the enzyme has binding capacity to insoluble cellulose and that this capacity is mediated through CBM9b, the external domain of the CBM9 tandem, which has been already reported for other enzymes with similar architecture. Together these results point Xyn10C as a potential candidate for application in agro-industrial processes that involve the degradation of straw and cereal biomass, a frequent by product of agriculture, such as bioethanol production, providing at the same time more insights on the biology of modular carbohydratases and on their contribution to xylan degradation in natural habitats.
A parede celular de células vegetais é uma estrutura rígida que permite que organismos multicelulares mantenham a sua forma e que possam crescer verticalmente. Esta parede celular tem uma composição complexa e variada, não só entre organismos, mas também consoante a idade e até entre tecidos do mesmo organismo. Não obstante, o seu maior componente é a celulose. Este polisacárido é composto por monómeros de glucose unidos por ligações glicosidicas β (1-4), criando uma estrutura filamentar. Estes polímeros individuais podem agrupar-se criando fibras de celulose. O segundo maior componente destas paredes é a hemicelulose. A cadeia principal deste polissacárido é estruturalmente semelhante à celulose no sentido em que é constituída por monossacáridos conectados por ligações β (1-4) mas neste caso é composta por diferentes açúcares sendo que a glucose é pouco frequente. De facto, o polímero hemicelulósico mais frequente é o xilano que tem a sua cadeia principal constituída por monómeros de xilose unidos por ligações β (1-4). Tal como outras hemiceluloses e contrariamente à celulose, os polímeros de xilano apresentam frequentemente ramificações constituídas por mono ou dissacáridos. A natureza destas ramificações está na base da nomenclatura de xilanos. Arabinoxilanos são polímeros de xilano que possuem uma frequência importante de ramificações compostas por arabinose unidas a uma xilose por meio de uma ligação α (1-3). Por outro lado, glucuronoxilanos possuem um número importante de ramificações de ácido D-glucurónico ou 4-O-metilglucurónico unidos por uma ligação α (1-2) ou mais raramente α (1-3). As cadeias de xilano provenientes de plantas gimnospérmicas superiores, também conhecidas por „softwoods‟, possuem os dois tipos de ramificações e são por isso denominados de glucuroarabinoxilanos. Nas plantas angiospérmicas superiores, ou „hardwoods‟, os glucuronoxilanos compõem a maioria dos polímeros de xilano e inclusive, a cadeia principal de xilose encontra-se acetilada em 60 a 70% dos monómeros. Em gramíneas, e particularmente nos cereais, a predominância é de arabinoxilano. Diversos microrganismos, incluído bactérias e fungos, têm a capacidade de degradar polímeros de xilano enzimaticamente. Devido à sua complexidade, a sua hidrólise total é mediada por diversos enzimas. As endoxilanases são enzimas que hidrolizam a cadeia principal de xilano em locais aleatórios resultando na sua divisão. Por outro lado, enzimas como arabinofuranosidases ou glucuronosidases são responsáveis pela remoção das ramificações. Para estes microrganismos, a degradação de polímeros de xilano permite não só utilizar os oligossacáridos resultantes para o seu metabolismo mas também aumentar a disponibilidade dos polímeros de celulose. Esta propriedade está na base da aplicação de xilanases de origem microbiana em processos industriais, nomeadamente no fabrico de papel onde a sua actividade facilita o branqueamento das pastas de papel o que se reverte numa diminuição da utilização de compostos de cloro, nocivos para o ambiente. Os enzimas xilanoliticos também podem ser utilizados para a clarificação de sumos e vinhos e melhorar a consistência de cerveja e as qualidades nutricionais de ração animal, nomeadamente de aves. Paenibacillus barcinonensis é uma bactéria Gram-positiva que foi isolada devido ao seu forte poder de degradação de xilano. O seu sistema xilanolítico parece ser complexo e é composto por diferentes enzimas. Três xilanases distintas foram já clonadas e caracterizadas, incluindo a endoxilanase C (Xyn10C), que constitui o objecto de estudo do presente trabalho. A análise da sua sequência proteica revelou que se trata de uma xilanase modular que para além do domínio catalítico, pertencente à família 10 das hidrolases glicosídicas (GH10), possuí ainda outros dois módulos de união a hidratos de carbono (CBM), cada um deles repetido em tandem. Do lado N-terminal do domínio GH10 encontra-se um módulo em tandem da família 22 (CBM22) e do lado C-terminal existe um módulo em tandem pertencente à família 9 (CBM9). Estas famílias compreendem membros que apresentam união a xilano e a celulose, respectivamente. A subdivisão de módulos tandem CBM9 foi ainda proposta em subfamília a) e b) em que membros da subfamília a) representam o módulo adjacente ao domínio catalítico e apresentam mutações em resíduos cruciais para a ligação ao substrato ao passo que membros da subfamília b) são os módulos externos de um tandem ou os módulos CBM9 que se apresentam isolados. Estes são capazes de se unir a celulose e a conservação das suas sequências proteicas admite maior previsibilidade quanto a esta capacidade para membros não caracterizados da subfamília. Consequentemente, a estrutura geral de Xyn10C pode ser esquematizada da seguinte forma: CBM22-CBM22-GH10-CBM9a-CBM9b. Num estudo prévio, os extractos celulares de uma estirpe Escherichia coli recombinante que expressava Xyn10C constutivamente foram utilizados para fazer uma caracterização da sua actividade enzimática. O substrato para o qual a enzima exibiu mais actividade foi glucuronoxilano proveniente de bétula seguido por arabinoxilano de aveia. Não foram detectados níveis importantes de actividade sobre celulose amorfa ou cristalina. A capacidade de união a celulose microcristalina, sob o nome comercial de Avicel, também foi demonstrada e foi sugerido que seria mediada pelo tandem CBM9a-b. A avaliação das funções de cada domínio individualmente, mas também de combinações seleccionadas, é um passo necessário para a compreensão do papel que desempenham em Xyn10C. Inclusivamente, este tipo de informação pode permitir, através de engenharia genética, desenhar enzimas com funções e qualidades específicas para determinado processo industrial, como o branqueamento de pastas de papel. Assim, a clonagem e caracterização de diferentes variantes truncadas de Xyn10C é crucial para perceber o seu verdadeiro potencial de aplicação industrial, o que também contribui para o conhecimento geral sobre enzimas modulares, e em particular, xilanases. Neste trabalho, foram clonadas, produzidas e purificadas diferentes variantes de Xyn10C. A proteína completa (sem péptido sinal) e o domínio catalítico GH10 foram produzidos em fusão com uma cauda de histidina na sua extremidade amínica (N) ao passo que o módulo tandem CBM9a-b e os módulos GH10-CBM9a-b foram produzidos com uma cauda de histidina na extremidade carboxílica (C). Esta cauda de histidina permitiu a purificação das proteínas de interesse através da afinidade que apresenta para iões de níquel (Ni2+). O módulo externo do tandem da família 9, CBM9b, foi ainda clonado em fusão com um domínio GST na sua extremidade amínica (N), permitindo a purificação da proteína fusão graças à sua afinidade para moléculas de glutationa. A actividade enzimática do enzima completo e do seu domínio catalítico GH10 foi determinada para 5 xilanos de origem diferente: glucuronoxilando de bétula (birchwood xylan - BIX) e de faia (beechwood xylan - BEX) e arabinoxilano de aveia (oat spelt xylan - OSX), centeio (rye xylan - RYX) e trigo (wheat xylan - WHX). As duas enzimas apresentaram um perfil de actividades específicas muito semelhante, ambas com maior actividade sobre RYX e menor sobre BIX. O único substrato que provocou diferenças significativas na actividade destes enzimas foi o WHX, sendo que a actividade do domínio catalítico GH10 foi menor. As actividades foram também medidas sobre as fracções solúveis e insoluveis de BEX e OSX de forma a compreender melhor o papel dos domínios de ligação a hidratos de carbono. Ambas as enzimas apresentaram actividades semelhantes entre BEX solúvel e insolúvel ao passo que a actividade sobre OSX insolúvel foi bastante menor que a actividade sobre OSX solúvel. Esta diminuição foi significantemente maior para o domínio catalítico GH10. Juntos estes resultados sugerem que a incorporação dos domínios tandem CBM22 e CMB9 ao domínio catalítico melhoram a sua capacidade de hidrólise para alguns arabinoxilanos ao passo que parece não influenciar a actividade sobre glucuronoxilanos. A proteína completa Xyn10C, o tandem CBM9a-b e o domínio CBM9b, enquanto unido ao domínio GST (GST-CBM9b), foram submetidos a ensaios de união a celulose microcristalina (Avicel). Através de métodos qualitativos para a actividade de celulose, nomeadamente tratamento zimográfico de géis de acrilamida, verificou-se que Xyn10C apresenta pouca afinidade para celulose. Resultados semelhantes foram obtidos para CBM9a-b e CBM9b indicando que a afinidade da proteína é mediada pelo domínio CBM9b e que esta afinidade é baixa nas condições testadas. No geral, este enzima apresenta maior preferência para arabinoxilanos. Corroborantemente, os domínios auxiliares de união a hidratos de carbono que possui promovem a actividade sobre certos arabinoxilanos e, em alguns casos, este efeito pode ser devido ao aumento da hidrólise da fracção insolúvel do substrato. Parece, portanto, que Xyn10C é um enzima que reflecte uma adaptação do organismo para o seu habitat, uma vez que foi isolado de um arrozal e o conteúdo de xilano da planta de arroz é maioritariamente arabinoxilano.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/6230
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