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Título: Medicago truncatula and water deficit: exploring a new method for trehalose 6-phosphate quantification and characterization of three abscisic acid responsive promoters
Autor: Alcântara, André Melão, 1987-
Orientador: Fevereiro, Manuel Pedro Salema, 1959-
Araújo, Susana de Sousa
Palavras-chave: Medicago truncatula
Stress hídrico
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Resumo: Condições ambientais adversas limitam fortemente o crescimento de plantas, levando a quebras anuais de produtividade em explorações agrícolas. Dos stresses vegetais, a falta de água é o factor que mais limita a produção. Para sobreviver em ambientes adversos, as plantas possuem mecanismos de defesa que aumentam a sua tolerância aos stresses impostos. Um desses mecanismos consiste na acumulação de um dissacárido fosfatado designado por trealo-se-6-fosfato (T6P). Até há relativamente pouco tempo, julgava-se que a presença de trealose e do seu intermediário na via de síntese apenas ocorria num grupo reduzido de espécies de plantas, conhecidas com “plantas da ressurreição”. No entanto, foi provado que acumulação de T6P induz a alteração de expressão de vários genes que estão envolvidos na resposta a esse mesmo stress. A sobreexpressão de genes da via de síntese da trealose, por manipulação genética, levou ao aumento de tolerância de várias espécies de plantas a diversos stresses abióticos, tais como o défice hídrico. No entanto, por também desempenhar um papel no desenvolvimento das plantas, essa mesma sobreexpresssão alterações no fenótipo das plantas transgénicas. Essa limitação foi ultrapassada, essencialmente pela utilização do gene da trealose fosfato sintase (TPS, na sigla inglesa) de Arabidopsis thaliana e de promotores induzidos por stress. Um dos maiores problemas em estudos sobre T6P em plantas é a sua ocorrência em baixas concentrações, sendo necessária utilização de técnicas muito sensíveis para a sua moni-torização. Nos últimos anos, muitos trabalhos têm sido elaborados no sentido de detectar e quantificar T6P em extractos vegetais. Foi proposto que a utilização de cromatografia líquida de alta pressão para separação de metabolitos em extractos vegetais acoplado a um espectrómetro de massa para detecção e quantificação (LC-MS, na sigla inglesa) seria o melhor sistema a utilizar para o fim pretendido. No entanto, existe um isómero da T6P, a sacarose-6-fosfato (S6P), que têm uma estrutura molecular muito semelhante ao da T6P e, como tal, interage de forma da mesma forma com as fases estacionárias testadas. Por terem o mesmo peso molecular e padrão de fragmentação, também não são passíveis de serem distinguidas pelo detector de MS. Neste trabalho foram explorados métodos para extracção e detecção de T6P com o intuito de determinar a concentração de T6P em tecidos de Medicago truncatula sujeitos a défice hídrico. Para tal, foram testados três métodos de extracção distintos para avaliar a eficiência de recuperação de açúcares fosfatados, na presença e ausência de material vegetal, com a adição de glucose-6-fosfato (G6P) no início do processo de extracção. Após ressuspensão em água, foi quantificada G6P por um método enzimático e comparados os três métodos de extracção. Dos extractos em que não foram adicionados tecidos vegetais, a extracção líqui-do-líquido (LLE, na sigla inglesa) foi a que apresentou melhores resultados, com eficiência de recuperação superior a 90 %. No entanto o mesmo processo de extracção registou valores de recuperação drasticamente mais baixos, da ordem dos 30 %, quando havia adição de folhas de M. truncatula maceradas. Essa limitação foi minimizada pela utilização de uma solução de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA, na sigla inglesa) a 1 % (p/v) na fase de extracção aquosa, subindo os níveis de recuperação para cerca de 70 %. Com o melhoramento do proto-colo de extracção LLE, os níveis de recuperação foram comparáveis às recuperações observa-das para os outros dois métodos de extracção, as extracções ácida e a etanólica. Foi ainda observado que a principal limitação da recuperação de açúcares fosfatados nos métodos de extracção ácida e etanólica resultava do próprio processo de extracção, uma vez que não havia um decréscimo significativo quando era utilizado material vegetal na extracção. Assim, concluiu-se que o protocolo LLE apresentava maior potencial em termos de extracção de açúca-res fosfatados, pelo que foi o escolhido para ser utilizado nos ensaios subsequentes. Após a aferição dos processos extractivos, seguiu-se para o método de detecção de T6P. Utilizou-se uma coluna de cromatografia de interacção hidrofílica (HILIC, na sigla inglesa), que já tinha sido descrita pela sua capacidade de separação de açúcares fosfatados. Nas condições testadas, não foi possível distinguir entre T6P e S6P por cromatografia nem na detecção por espectrometria de massa. Foi também testado se as moléculas teriam um pico de absorção a comprimentos de onda distintos, possibilitando a sua diferenciação ao nível do Detector de diodos UV-Vis do sistema de cromatografia líquida de alta performance (HPLC, na sigla inglesa). No entanto, essa diferença não foi observada, tendo-se registado um pico de absor-ção aos 190 nm em soluções de ambas as moléculas. Por esse motivo, considerou-se a utilização de um processo degradativo, que fosse selectivo para uma das moléculas, possibilitando assim a sua distinção e quantificação. Pela inexistência de enzimas comerciais que fizessem essa distinção, pensou-se na utilização de enzimas que pudessem hidrolisar as moléculas após se proceder à desfosforilação das mes-mas. A invertase é um enzima comummente utilizado para a hidrólise da sacarose em glucose e frutose. Os testes em soluções aquosas de sacarose, S6P, trealose e T6P mostraram que o enzima apenas tinha a capacidade de hidrolisar a sacarose, não se tendo registado qualquer degradação nas outras amostras testadas. De seguida foi testada utilização de uma fosfatase alcalina (AP, na sigla inglesa) para a desfosforilação de T6P e S6P. A completa desfosforilação de ambas as moléculas foi registada ao fim de 8 horas de incubação. Assim, concluiu-se que seria possível a distinção de T6P e S6P utilizando um processo enzimático em duas fases, onde seria promovida a desfosforilação de ambas as moléculas seguindo-se a hidrólise da sacarose, possibilitando a quantificação de trealose resultante do processo de desfosforilação. Em alternativa, foi testada a possibilidade de distinguir a sacarose da trealose utilizando trealase. Este enzima provoca a degradação da trealose levando à formação de duas moléculas de glucose. Foi provado que a trealase tinha a capacidade de hidrolisar selectivamente as moléculas de trealose, não provocando qualquer alteração em moléculas de sacarose, pelo que também poderá ser utilizado para a distinção entre T6P e S6P após desfosforilação. O ácido abscísico (ABA) é uma hormona vegetal cuja síntese e libertação é estimulada em resposta a vários stresses, tanto bióticos como abióticos, provocando respostas fisiológicas e alteração da expressão de genes em resposta a esses mesmos stresses. A sobreexpressão de genes provocada pelo aumento da concentração de ABA nas células vegetais é atribuída essencialmente a dois motivos genéticos presentes nas sequências reguladoras, os promotores, desses mesmos genes, o ABA-responsive element (ABRE) e os coupling elements (CEs). Num trabalho anterior tinham sido estudados doze promtores que continham ambos os moti-vos e a expressão dos genes regulados por esses promotores foi quantificada. Para este traba-lho, foram escolhidos três promotores cujas sequências foram ligadas à sequência codificante de um gene repórter, o da ß-glucuronidase (GUS). Folíolos de M. truncatula foram infectados com estirpes de Agrobacterium tumefaciens que continham as construções promotor-gene repórter e testou-se se a adição de ABA ou a imposição de stress hídrico induzido por polietilenoglicol (PEG) ao meio de cultura levaria a um aumento da expressão do gene gus. A análise de expressão transiente, efectuada por con-tagem dos focos azuis não mostrou diferenças significaitivas na actividade de GUS. O mesmo resultado foi obtido quando se comparou a área azul estimada entre os tratamentos. Estes resultados sugerem que as diferenças ao nível da expressão de genes regulados pelos promotores utilizados poderão ser demasiado baixas para serem analisadas por ensaios de expressão transiente.
A method for extraction and detection of trehalose 6-phosphate (T6P) in Medicago truncatula extracts was explored. Three extraction protocols - ethanolic, acid, and liquid-liquid - were tested in order to determine which would have the capacity to recover a greater percentage of phosphorylated sugars. Almost the complete quantity of the glucose 6-phosphate in spiked extracts was detected using the liquid-liquid extraction procedure in samples without plant material. When grinded leafs were added the recovery decreased to 30%, but the addition of EDTA improved the recovery efficiency up to approximately 70%. The LC-MS detection of standard solutions showed that T6P could not be separated from its isomer sucrose 6-phosphate (S6P). Thus, two two-step enzymatic processes were designed. Invertase and trehalase are two enzymes that were assayed to assess whether they would specifically hydrolyze one of the isomers. Invertase was proven to hydrolyze specifi-cally sucrose molecules, whereas trehalase only hydrolyzed trehalose molecules. The ability of alkaline phosphatase (AP) to dephosphorylate unspecifically S6P and T6P, leading to the assumption that T6P could be quantified by dephosphorylation of plant extracted metabolites with AP followed by specific hydrolysis with either invertase or trehalase, using suitable blank controls. Abcscissic acid (ABA) is a plant hormone involved in stress signaling, that has been re-ported to upregulate the expression of genes controlled by promoters that include ABA-responsive element (ABRE) and coupling elements (CEs) sequences. Three reporters with ABREs and CEs were fused to the ß- glucuronidase (GUS) reporter gene and plant transfor-mation was performed. Transient analysis of the reporter gene did not show any differences upon ABA exogenous application nor polyethylene glycol induced water stress, suggesting that changes in gene expression might be too low for detection by transient expression analysis.
URI: http://hdl.handle.net/10451/6231
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