Universidade de Lisboa Repositório da Universidade de Lisboa

Repositório da Universidade de Lisboa >
Faculdade de Ciências (FC) >
FC - Dissertações de Mestrado >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/6233

Title: The recU-pbp2 operon in Staphilococcus aureus
Authors: Pereira, Ana Raquel Ramos, 1988-
Advisor: Pinho, Mariana
Chaves, Sandra Isabel Mourinha Lopes, 1974-
Keywords: Biologia molecular
Staphylococcus aureos
Resistência aos antibióticos
Expressão génica
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: World wide spread of multidrug resistant Staphylococcus aureus pathogen and the ability to infect healthy individuals in the community calls for development of new chemotherapies against this pathogen, as well for deeper knowledge of its antibiotic resistance mechanisms. PBP2 is a protein that catalyzes the last stages of cell wall synthesis at the bacterial septum and is involved in β-lactam resistance. The pbp2 gene is encoded within an operon where it is transcribed either alone or together with recU, which encodes for a non biosynthetically related protein, a Holliday junction resolvase. In Bacillus subtilis RecU is a key enzyme in homologous recombination and is fundamental to chromosome segregation and DNA repair. In this work we aimed to investigate the function of recU in S. aureus and to determine if it needed to be co-regulated with pbp2 to ensure coordination between septum synthesis and chromosome segregation. We therefore characterized RecU function in S. aureus and showed that it is indeed involved in DNA damage repair and chromosome segregation. As PBP2 and RecU are two proteins fundamental for cell division, a process which requires tight coordination between chromosome replication/segregation and septum synthesis, we asked if co-expression of pbp2 and recU would constitute a possible checkpoint for the cell division process. Through uncoupling the regulation of these two proteins we concluded that the recUpbp2 operon does not constitute a checkpoint in cell division in S. aureus, neither during normal growth, nor during exposure to DNA damaging compounds and β-lactams.
Staphylococcus aureus é uma bactéria patogénica nosocomial com uma enorme capacidade de adaptação a diferentes ambientes. Ao longo do tempo a sua evolução levou ao aparecimento de estirpes Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (conhecidas pela sigla inglesa como MRSA) que são hoje em dia virtualmente resistentes a todos os antibióticos disponíveis e que possuem a capacidade de matar pessoas saudáveis na comunidade. A elevada mortalidade de infecções causadas por S. aureus, e as opções limitadas de quimioterapias eficazes dão ênfase à necessidade de descoberta de novas estratégias de tratamento e à importância do conhecimento dos mecanismos de resistência aos antibióticos adquiridos por esta bactéria patogénica. Uma das principais e mais eficazes classes de antibióticos é constituída pelos β-lactâmicos que têm como alvo a síntese da parede celular bacteriana, mais precisamente as proteínas de ligação à penicilina (PBPs). Quando estas proteínas são aciladas por β-lactâmicos perdem a capacidade de fazer o “crosslinking” do peptidoglicano, o que leva à lise celular. Porém estirpes MRSA são capazes de crescer normalmente na presença de elevadas concentrações de β-lactâmicos, devido à aquisição de uma proteína adicional (PBP2A). Apesar desta proteína ser fundamental para a aquisição da resistência à meticilina, o mecanismo de resistência aparenta ser muito mais complexo, envolvendo proteínas nativas que são codificadas por um grupo de genes denominados por aux ou fem cuja ausência tem como consequência a redução da resistência aos β-lactâmicos. S. aureus possui quatro PBPs nativas que catalisam os últimos passos da síntese do peptidoglicano, mas apenas a PBP2 é bifuncional, capaz de realizar as reações de transglicosilação e transpeptidação que originam longas cadeias de peptidoglicano ligadas por pontes de cinco glicinas. Esta proteína está incluída no grupo dos genes fem, pois a sua inativação leva a uma redução bastante acentuada na resistência aos β-lactâmicos. A proteína PBP2 é codificada por um operão que contém a montante um gene sem aparente relação biossintética com a PBP2 e que, por homologia com Bacillus subtilis, foi denominado por recU. Neste operão o gene pbp2 é assim transcrito a partir de dois promotores que dão origem a dois transcritos distintos, um que contém a sequência de mRNA correspondente apenas à pbp2 e outro transcrito que possui as sequências de mRNA quer de recU quer de pbp2. Os dois genes sobrepõem-se por dois nucleótidos e na extremidade 3’ de recU situam-se as sequências reguladoras que originam o transcrito que contém apenas o mRNA da pbp2. Este operão é aparentemente conservado em outras espécies Gram-positivas tais como B. subtilis, onde a função de RecU foi previamente estudada. Em B. subtilis recU codifica para uma resolvase de “Holliday junctions”, enzima que catalisa o passo fundamental de clivagem da “Holliday junction” durante o processo de recombinação homóloga. RecU é também uma proteína fundamental para a reparação de danos no DNA e segregação cromossómica em B. subtilis. Assim, neste trabalho, começámos por estudar a função de RecU em S. aureus construindo uma estirpe cujo gene recU foi eliminado mas em que cuidadosamente mantivemos a região 3’ do gene, que corresponde às sequências reguladoras da pbp2. Ao analisar o crescimento de S. aureus na ausência de RecU verificámos que estas estirpes têm um crescimento significativamente mais lento. Investigámos depois a razão para tal diminuição da taxa de crescimento, nomeadamente através da observação das células após marcação do seu DNA ao microscópio de fluorescência e concluímos que o decréscimo da taxa de crescimento se deve provavelmente à alteração da morfologia do nucleiode e à incapacidade das células segregarem os cromossomas para as células filhas durante o processo de divisão celular. Para confirmar a hipótese de que tais aberrações no DNA resultam de uma incapacidade de reparação do DNA por parte dos mutantes S. aureus sem RecU, incubámos estirpes de S. aureus que não produzem RecU com compostos que danificam o DNA e verificámos que os mutantes são muito mais sensíveis a estes compostos do que as estirpes parentais. Assim nesta tese demonstrámos que RecU é uma proteína fundamental em S. aureus para o crescimento bacteriano, estando envolvida na reparação de DNA e na segregação cromossómica. Também verificámos que a ausência de RecU numa estirpe que possui um profago no seu genoma leva à lise maciça das células bacterianas. Esta lise pode ser justificada pelo fato de, na ausência de RecU, o DNA danificado induz a ativação do sistema SOS (modelado por RecA e LexA) que leva consequentemente à indução do ciclo lítico do profago, que produz particulas fágicas e lisa as células. Um outro objetivo deste trabalho foi encontrar uma explicação biológica para que duas proteínas que aparentemente não têm qualquer relação biosintética (PBP2 e RecU) sejam coexpressas num operão. Dado que PBP2 é uma proteína fundamental para a síntese da parede celular, processo que ocorre no septo bacteriano durante a divisão celular, e RecU está envolvido na segregação cromossómica, a co-regulação da biossíntese destas duas proteínas poderia ser um fator fundamental para evitar a formação de septos sobre o DNA e assim coordenar a divisão celular. Para testar esta hipótese criámos uma estirpe em que recU foi eliminado do seu locus nativo mas é expresso ectopicamente no locus spa sob controlo do promotor Pspac,, um promotor indutível por IPTG e reprimível pela proteína LacI. Assim, nesta estirpe podemos controlar a expressão de recU de um modo completamente independente da expressão de pbp2, eliminando assim a co-expressão/co-regulação dos dois genes. Ao incubar esta estirpe com IPTG (que induz a expressão de recU) verificámos que o crescimento era igual ao da estirpe “wild-type” e que esta não possuía danos no DNA indicando que S. aureus é capaz de crescer normalmente em condições em que recU e pbp2 são regulados independentemente. Em seguida incubámos estas células na presença de β-lactâmicos e de compostos que danificam o DNA e verificámos que a expressão ectópica de recU é suficiente para a estirpe indutível recuperar o fenótipo “wild-type”, pelo que a co-expressão de recU e pbp2 também não é necessária nestas condições. Uma outra hipótese para explicar a presença de recU e pbp2 no mesmo operão seria o fato de RecU regular a atividade da PBP2 ou ser necessário para que a PBP2 seja funcional. Com o objetivo de testar a funcionalidade do domínio da transpeptidase da PBP2 na ausência de RecU, e dado que a atividade de transpeptidase é essencial para a viabilidade de uma estirpe MSSA, eliminámos a sequência codificante de recU na estirpe sensível NCTC 8325-4. O fato de conseguirmos crescer esta estirpe na ausência de RecU indica que a atividade de transpeptidase da PBP2 é mantida. A atividade de transglicosilase da PBP2 é essencial para a resistência ao β-lactâmico oxacilina. Assim para testar se este domínio está funcional na ausência de RecU procedemos à determinação da concentração mínima inibitória (CMI) para a oxacilina no mutante recU indutível na ausência de IPTG e observámos uma ligeira redução. Porém dado que a inativação do domínio transglicosilase da pbp2 causa uma perda massiva da resistência, esta ligeira redução não é relevante para indicar a perda de actividade de transglicosilase da PBP2 na ausência de RecU. Esta ligeira redução no CMI para a oxacilina é recuperada caso RecU seja sintetizado ectópicamente. Para esta ligeira influência de RecU na resistência à oxacilina propomos várias hipóteses: (i) o efeito indireto dos danos no DNA que implica severos defeitos no crescimento poderá, de alguma forma influenciar a capacidade de resistência aos β- lactâmicos; (ii) na ausência de RecU existe uma ligeira diminuição na expressão da PBP2 que poderá ser recuperada caso RecU esteja presente ou (iii) RecU está envolvido na resistência a β-lactâmicos através de um mecanismo desconhecido. Neste trabalho, através do desacoplamento da expressão de recU e pbp2, concluímos que a expressão coordenada destes genes não é crucial para a divisão celular em S. aureus, quer durante o crescimento aeróbio, quer quando S. aureus é sujeito à acção de β-lactâmicos ou de compostos que danificam o DNA. Concluímos ainda que RecU é uma proteína necessária para a reparação do DNA em S. aureus.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/6233
Appears in Collections:FC - Dissertações de Mestrado

Files in This Item:

File Description SizeFormat
ulfc092781_tm_ana_pereira.pdf10.74 MBAdobe PDFView/Open
Restrict Access. You can request a copy!
Statistics
FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpaceOrkut
Formato BibTex mendeley Endnote Logotipo do DeGóis 

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

 

  © Universidade de Lisboa / SIBUL
Alameda da Universidade | Cidade Universitária | 1649-004 Lisboa | Portugal
Tel. +351 217967624 | Fax +351 217933624 | repositorio@reitoria.ul.pt - Feedback - Statistics
DeGóis
  Estamos no RCAAP Governo Português separator Ministério da Educação e Ciência   Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Financiado por:

POS_C UE