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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/6280

Título: Ecology of conjugative plasmids
Autor: Moreira, Bernardino Machado, 1988-
Orientador: Dionísio, Francisco, 1971-
Reis, Ana Maria Gonçalves, 1958-
Palavras-chave: Microbiologia
Resistência aos antibióticos
Plasmídeos
Escherichia coli
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Resumo: Bacterial conjugation is an important process which allows for the transference of plasmids between different bacteria. Plasmids may be useful for the bacteria in the way they carry genes that code for antibiotic resistance and other beneficial traits. Previous work has showed a great diversity of conjugation efficiency for several strains of Escherichia coli with the plasmid R1. We studied the conjugation efficiency of five plasmids (R16a, R702, RP4, R124 and R477-1) belonging to five different incompatibility groups. We observed a great diversity of conjugation efficiency, depending on the donor strain, on the recipient strain and on the plasmid to be transferred. Moreover, we observed that plasmids present in a donor strain influence the conjugation efficiency of a newly inserted plasmid. Other studies showed that, although plasmids can be advantageous under certain conditions, they normally impose a cost to the host. That cost can be assumed as the plasmid’s virulence and it can evolve accordingly with models of evolution of virulence. It has been shown that the cost of harboring a plasmid can be minimized by means of co-evolution. Also, it can be influenced by epistatic interactions with the host’s genome or other plasmids. We observed that R16a didn’t impose fitness cost to any host, that R477-1 conferred and advantage to one donor strain and cost to other two strains. We could not pick a model of virulence evolution (trade-off hypothesis or within host competition hypothesis), to explain the different fitness values obtained. Epistatic interactions between plasmids and bacterial genome or other plasmids may also have influenced the fitness values we obtained. We also confirmed that through co-evolution, the cost for an E.coli strain to carry the plasmid R477-1 was compensated, and that this fitness change didn’t have a direct relationship with the conjugation efficiency for this plasmid-donor strain dyad.
A resistência a antibióticos constitui um grande desafio para a medicina moderna (Martinez et al, 2009). A aquisição de resistência a antibióticos pode resultar de mutações espontâneas em genes cromossomais, ou de eventos de transferência horizontal de genes que codifiquem para resistência a antibióticos. A transferência horizontal de genes (THG) compreende processos que permitem a troca de genes entre dois organismos para além da herança de material genético da célula-mãe para a célula-filha. É um fenómeno de grande importância em termos da evolução de procariotas (Andam et al, 2010), que permite o surgimento de grande variabilidade e inovação metabólica ao nível dos organismos procariotas. A THG ganha assim importância em termos médicos, uma vez que é um grande veículo de disseminação de resistência a antibióticos. Os principais processos de THG são a transformação, a transdução e a conjugação. A transformação consiste na absorção de ADN livre nas proximidades do microrganismo (Brigulla & Wackernagel, 2010). A transdução consiste no transporte de genes entre bactérias através de um bacteriófago (Skippington & Ragan, 2011). A conjugação consiste na transferência de plasmídeos entre bactérias em contacto estrito. Os plasmídeos são elementos genéticos com replicação independente da do cromossoma da célula hospedeira. Estes não apresentam forma extracelular e, consequentemente, têm que ser transmitidos entre hospedeiros. Esta transferência pode dar-se aquando da divisão celular (transferência vertical) ou por um processo replicativo designado por conjugação (Willetts & Wilkins, 1984). O processo de conjugação envolve proteínas responsáveis pelo contacto célula a célula, e pela transferência do plasmídeo através das membranas celulares (Christie et al, 2005; Silverman, 1997). Uma bactéria pode albergar vários plasmídeos. Estes são classificados em grupos de incompatibilidade. Dois plasmídeos dizem-se incompatíveis sempre que, após a sua coexistência num mesmo hospedeiro, um deles não é mantido após a divisão celular, devido a interferência nos sistemas de controlo da replicação dos plasmídeos (Novick, 1987; Petersen, 2011). Sistemas de repressão da conjugação, tais como a exclusão de superfície (Frost et al, 1994) ou sistemas de restrição do hospedeiro (Jeltsch, 2003) podem funcionar como barreiras à conjugação. A replicação e manutenção dos plasmídeos, bem como a expressão dos genes que estes possam conter, quando em situações em que a bactéria não beneficia dos produtos desses genes, implica uma diminuição do fitness da célula hospedeira, que se verifica na diminuição da taxa de crescimento (Dahlberg & Chao, 2003; Dionisio et al, 2005; Lenski & Bouma, 1987; Modi & Adams, 1991). Este custo pode ser reduzido por estratégias, tais como a co-evolução entre o plasmídeo e o hospedeiro (Dahlberg & Chao, 2003; Dionisio et al, 2005; Lenski & Bouma, 1987; Modi & Adams, 1991), a redução do número de cópias do plasmídeo por célula (Dionisio et al, 2005), ou a redução das taxas de conjugação por sistemas que reprimam a síntese do aparato proteico associado à conjugação (Dionisio et al, 2002; Haft et al, 2009). O custo imposto por um plasmídeo pode ser interpretado como virulência para a célula hospedeira. Existem diversas hipóteses propostas para a evolução da virulência. Uma delas propõe que a virulência evolui tendo em conta o balanço final entre transmissão infecciosa e o dano provocado ao hospedeiro (Alizon et al, 2009; Anderson & May, 1982). Considerando os plasmídeos, o custo que este impõe ao hospedeiro evoluiria no sentido de se encontrar um ponto óptimo entre transmissão infecciosa (conjugação) e o custo causado ao hospedeiro. Outra hipótese propõe que o custo evolui maioritariamente devido a competição de diferentes genótipos patogénicos dentro do mesmo hospedeiro (co-infecção ou superinfecção). Assim, diferentes plasmídeos num mesmo hospedeiro competiriam entre si, sendo seleccionados os plasmídeos com maior capacidade da usar os recursos celulares, ainda que isso leve a uma diminuição global do fitness do hospedeiro. Mais ainda, foi demonstrado que os plasmídeos podem interagir com mutações em genes cromossomais, ou com outros plasmídeos, levando a alterações do fitness global do hospedeiro. Essa interacção é denominada epistasia (Silva et al, 2011). Assim, tendo em conta a importância da THG, e particularmente da conjugação, como veículo de transmissão de genes de resistência a antibióticos, é de interesse estudar a dinâmica da transferência de plasmídeos entre microrganismos comensais, para melhor se entender como é que estes microrganismos contribuem para o espalhamento de plasmídeos. Este trabalho pretendeu portanto, estudar a eficácia de conjugação de cinco plasmídeos com genes de resistência a antibióticos (R16a, R124, R702, RP4 e R477-1), utilizando quatro estirpes de Escherichia coli como estirpes dadoras do plasmídeo, e as mesmas estirpes recipientes do plasmídeo usadas por Dionisio et al (2002). Obteve-se uma grande variabilidade de eficácia de conjugação. Os valores obtidos abrangeram oito ordens de grandeza. Verificámos que a melhor estirpe dadora é a estirpe E.coli M3, a pior dadora é a estirpe E. coli Vdg435. A estirpe E.coli M1412 é a estirpe com menor capacidade para receber qualquer um dos plasmídeos utilizados. Esta variabilidade é influenciada pela estirpe dadora do plasmídeo, pela estirpe que o vai receber, pelo plasmídeo em si, e pelas interacções entre estes três factores. Considerando também que Dionisio et al (2002) observaram que, após tratamento de todas as estirpes dadoras para remover todos os plasmídeos (curar as bactérias), as suas taxas de conjugação para o plasmídeo R1 eram homogéneas, independentemente da diferença observada antes da remoção dos plasmídeos, averiguámos o conteúdo em termos de plasmídeos das estirpes dadoras escolhidas para este trabalho. Verificámos que a estirpe E.coli Vdg435, contém, para além dos plasmídeos que introduzimos, outros plasmídeos. As outras três estirpes dadoras não hospedam qualquer plasmídeo para além dos que nós introduzimos neste estudo. Inferimos assim que a presença de outros plasmídeos para além dos que introduzimos nas estirpes dadoras influencia a sua capacidade dadora. Vimos também que a introdução dos cinco plasmídeos nas estirpes dadoras influencia o fitness destas: a introdução do plasmídeo R16a não altera o fitness das estirpes dadoras; a introdução dos plasmídeos R124, RP4 e R702 induz uma diminuição do fitness da estirpe E.coli Vdg435; o plasmídeo R477-1 impõe um custo de fitness nas estirpes E.coli M3 e M4, e confere uma vantagem à estirpe E.coli Vdg435. Estas alterações podem ser explicadas recorrendo a modelos que expliquem a evolução da virulência – competição dentro do hospedeiro, ou balanço entre virulência e transmissão infecciosa – ainda que nenhum dos dois modelos explique a totalidade dos resultados. Outra explicação passa pela ocorrência de interacções entre os plasmídeos inseridos nas estirpes dadoras e mutações nos cromossomas destas que causem resistência a antibióticos, ou com plasmídeos já existentes nas estirpes dadoras – epistasia. Este fenómeno pode explicar alguns dos valores obtidos (nomeadamente a vantagem conferida pelo plasmídeo R477-1 à estirpe dadora E.coli Vdg435). Com o intuito de verificar se o custo provocado por um plasmídeo, bem como a sua evolução, podem influenciar a eficiência de conjugação desse plasmídeo, e tendo em conta que esse custo pode ser diminuído por co-evolução entre o plasmídeo e o hospedeiro, (Dahlberg & Chao, 2003; Dionisio et al, 2005; Lenski & Bouma, 1987; Modi & Adams, 1991) evoluímos a estirpe E.coli M3 com o plasmídeo R477-1 por cerca de 658 gerações. Verificámos que, de facto, ocorreu uma compensação do custo imposto pelo plasmídeo. Fizemos medições das taxas de conjugação do plasmídeo evoluído na estirpe dadora evoluída e verificámos que, para metade das estirpes dadoras, a taxa de conjugação aumentou significativamente. Para as restantes estirpes receptoras, não houve alteração significativa. Pudemos então concluir que não existe uma relação directa entre o custo que determinado plasmídeo impõe ao seu hospedeiro e a sua eficiência de conjugação.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/6280
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