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Título: Efeito do oncogene BRAF e da GTPase Rac1b sobre a expressão dos genes envolvidos no estado de senescência de células do cólon humano
Autor: Henriques, Andreia Filipa Almeida, 1988-
Orientador: Gomes, Rui Artur Paiva Loureiro, 1958-
Jordan, Peter
Palavras-chave: Biologia molecular
Cancro do colo-rectal
Expressão génica
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Resumo: O cancro colo-rectal é uma das principais causas de morte no mundo ocidental. Trata-se de uma doença heterogénea com diferentes vias de desenvolvimento, uma das quais é a Via Serreada caracterizada pela ocorrência de mutações no gene BRAF nomeadamente a mutação BRAF V600E. No entanto ensaios feitos com a mutação BRAF V600E mostraram que esta não é suficiente para induzir a transformação maligna e provoca em vários tipos celulares Oncogene Induced Senescence – OIS. O facto de ter sido encontrada sobre expressão de Rac1b em amostras de tumores e ter sido demonstrada uma cooperação entre BRaf-V600E e Rac1b para a sobrevivência celular em células HT29 sugeriu esta GTPase como interveniente na transformação maligna quando a mutação BRAF V600E está presente. Estudos preliminares sugeriram então a hipótese de haver comunicação celular por via de citocinas, nomeadamente, PDGF-BB e IL-8 entre a célula tumoral e células do estroma durante o processo de progressão tumoral envolvendo a expressão do receptor CXCR4. Foi então criado um novo modelo celular de células normais de cólon, NCM460, transformadas com o sistema indutível (ProteoTuner – Clontech) para estudar os efeitos da expressão de Rac1b e BRaf-V600E. Os níveis de expressão dos inibidores de proliferação p14ARF e p15INK4b aumentaram nas células NCM460 transfectadas com pPTuner BRaf-V600E indicando indução de OIS. Já a expressão de Rac1b apresenta efeito antagónico, inibindo a expressão de marcadores de senescência e ainda um aumento da expressão de IL-8. Sendo o IL-8 um estímulo para a produção de SDF1 pelo estroma o efeito da activação do receptor de SDF1, o CXCR4, na expressão de Rac1b foi mimetizado pela sua sobre-expressão nas NCM460. Os resultados sugerem que CXCR4 provoca um aumento da expressão de Rac1b para níveis semelhantes aos encontrados em células tumorais. Os resultados deste trabalho sustentam o modelo de OIS induzido pela mutação BRaf-V600E numa célula de cólon normal e que Rac1b tem um efeito contrário. Posteriormente, por um processo que ainda é necessário definir ocorre na célula aumento da expressão de Rac1b criando um ciclo de retro alimentação entre a célula tumoral e as células envolventes do estroma pelo eixo IL-8- SDF-1- CXCR4 que sustenta a expressão de Rac1b e conduz a progressão tumoral.
Colorectal cancer (CRC) represents one of the leading causes of cancer mortality in the Western world. It is a heterogonous disease that can evolve through different pathways, one of them called the serrated polyp pathway. Serrated tumors follow a neoplastic pathway that does not involve mutations in KRAS but is characterized by mutations in BRAF oncogene. However, in cell transformation assays the most frequent BRAF mutation B-Raf-V600E exhibited a much lower transforming activity than oncogenic Ras. In fact, BRaf-V600E leads to oncogene-induced senescence (OIS) linked to increased expression of cell cycle inhibitors in several cell types. The recent discovery that B-Raf-V600E and hyperactive Rac1b functionally cooperate in tumour cell survival led to the hypothesis that tumours are initiated by a B-Raf-V600E mutation but later require overexpression of Rac1b to overcome senescence and allow further tumour progression. Preliminary data suggested that Rac1b overexpression may involve cellular communication between cancer and stroma cells and involve the cytokines PDGF-BB and IL-8 and the receptor CXCR4. A new cellular model was established with normal colon cells, NCM460, transformed with the inducible system (ProteoTuner - Clontech) to study the effect of Rac1b and BRAF-V600E expression. The expression levels of cell cycle inhibitors p14ARF and p15INK4b decreased upon expression of BRAF-V600E, compatible with induction of OIS. In contrast, Rac1b expression inhibited expression of these senescence markers while increasing IL-8 expression. Because IL-8 is known to stimulate stromal fibroblast to secrete SDF-1, overexpression of the SDF1 receptor CXCR4 was used as a way to mimic its activation in NCM460 cells. Under these conditions, Rac1b expression increased to levels similar to those found in tumor cells. The results of this study support a model in which a BRAF-V600E mutation in normal colon cell promotes OIS which is counteracted by Rac1b. How Rac1b overexpression is promoted remains undefined but it could create a positive feedback cycle by increasing IL8 secretion to stimulate SDF1 production by surrounding stromal cells which leads to CXCR4 activation and sustained Rac1b expression in tumor cells required for tumor progression.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/6286
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