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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/6309

Title: Optimization of low serum human umbilical cord matrix mesenchymal stem cell (umcMsC) culture for conditioned media preparation: in vitro and in vivo wound healing applications
Authors: Filipe, Elysse Cebola, 1987-
Advisor: Rodrigues, Maria Gabriela, 1965-
Miranda, Joana
Keywords: Embriologia
Células estaminais
Terapia génica
Murganhos
Ovinos
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Abstract: Research in the area of mesenchymal stem cells (MSCs) has come to prove the extensive therapeutic value of these cells. Increasing evidence supports that MSCs play a role in tissue regeneration not by means of cellular engraftment and differentiation, but through the secretion of soluble trophic factors which enhance and assist in the repair and regeneration of damaged tissues by paracrine activation of surrounding cells. This thesis aims to evaluate the therapeutic value of conditioned media prepared from umbilical cord matrix derived MSC (ucmMSC) culture on cellular migration and wound regeneration. For this purpose an in vitro migrational scratch assay in human dermal fibroblasts and in human keratinocytes; and an in vivo wound healing assay in the mouse model were performed. A novel ovine model for the wound healing assay was also developed. Conditioned media containing 0% and 2% FBS were prepared with confluent or growing ucmMSCs cultures and growing bmMSC and applied to the models mentioned above. Media supplemented with 0% and 2% FBS that were not in contact with cells were herein used as controls. Overall, it could be observed that conditioned media enhanced cellular migration when compared to the respective controls. Moreover, it was concluded that growing MSCs secreted a richer protein profile which resulted in increased cellular migration and consequent wound healing, further validating the therapeutic value of MSCs in cutaneous wound healing via secretion of soluble trophic factors. Since the use of ucmMSCs represents an inexhaustible source of easily isolated MSCs from a non-controversial origin, future mass production of MSC trophic factors could be achieved in an off-the-shelf manner. The prospective of a commercially available concentrate of MSC secreted factors which accelerates the healing of cutaneous injuries upon topical application would be a momentous achievement, reducing the invalidity and morbidity associated with cutaneous wounding and excessive scarring.
Durante todo o desenvolvimento embrionário, desde do oócito fertalizado até ao feto desenvolvido, as células atravessam vários estádios de potência. Desde a célula totipotente que existe até à 3ª divisão celular [1], à celula pluripotente existente no botão embrionário do blastocisto e que após isolamento é conhecido como célula estaminal embrionária [1-2], até às células progenitoras dos diversos orgãos que permanecem durante toda a vida do organismo [1]. A célula estaminal mesenquimatosa, em particular, é um subtipo de célula estaminal multipotente, capaz de se diferenciar em vários tecidos da linhagem da mesoderme. Estas células existem em vários tecidos extra-embrionários, fetais e adultos, tais como: o sangue, fígado e medula óssea fetais [3]; o saco e líquido amnióticos, a placenta [4-5], o sangue do cordão umbilical [6] e a matriz do cordão umbilical [7] e; em vários tecidos adultos como a medula óssea, o tecido adiposo, o timo, o cérebro, o fígado, o pulmão, o rim, a artéria aorta e o músculo, entre outros [1, 8-9]. Por definição, uma célula estaminal mesenquimatosa é aderente, expressa os marcadores de superfície CD105, CD73 e CD90 e não expressa os marcadores CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR, e é capaz de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos e adipócitos [10]. As células estaminais mesenquimatosas contam com inúmeras características particulares que fazem com que estas sejam alvo, cada vez mais, de investigação na área da terapia celular. Estas células são fáceis de manter em cultura, nomeadamente por dispensarem o uso de feeder-layers, obrigatório na cultura de células estaminais embrionárias [11], e apesar de não terem uma capacidade de replicação infinita, que geralmente leva à instabilidade genómica, são capazes de produzir um grande pool de células genéticamente estáveis [12], essencial para a aplicação em terapia celular humana. A terapia génica é também uma área onde a utilização destas células é promissora, uma vez que, as mesmas têm provado ter a capacidade de ser transfectadas com ADN exógeno [13-14]. Uma das vantagens mais importante das células estaminais mesenquimatosas é a facilidade de isolamento a partir de uma variedade de tecidos extra-embrionárias e adultas, como tal, insenta da controvérsia que rodeia o uso de células estaminais embrionárias. Outras características destas células que as tornam cada vez mais interessantes são a sua capacidade de modular o sistema imunitário e assim reduzir a inflamação e, no caso de um transplante, induzir a tolerância às células administradas [15-16]; a tendência destas células de migrarem para tecidos lesados onde interagem com as células inflamatórias, diferenciam e libertam factores que promovem a regeneração do tecido [11]; e a sua extensa capacidade de diferenciação que vai além dos tecidos da mesoderme obrigatórias para a sua caracterização, como sejam os cardiomiócitos [17], e células da endoderme e ectoderme tais como os hepatócitos [18], as células produtoras de insulina [19] e os neurónios [20]. Uma outra característica cada vez mais evidente das células estaminais mesenquimatosas é a sua acção em lesões, onde a presença destas células leva à regeneração do tecido sem evidências de diferençiação [21]. De facto, pensa-se que as células estaminais mesenquimatosas libertam factores tróficos que activam, por acção parácrina, as células circundantes levando a uma regeneração do tecido mais rápida e eficiente [21]. Foi a partir destas descobertas mais recentes que este projecto foi desenhado, tendo como objectivo principal desvendar o papel de células estaminais mesenquimatosas isoladas a partir da matriz do cordão umbilical em lesões cutâneas, procurando também saber as condições de cultura mais favoráveis à libertação destes factores tróficos. A pele é um orgão que desempenha funções homeostáticos e de protecção imprescindíveis à nossa sobrevivência, por isso a sua capacidade de regeneração é tão importante. A reacção que ocorre no local da lesão é um processo dinâmico que requer a interacção de diversos tipos celulares. É controlado por uma gama de factores de crescimentos e de citocinas secretadas no local [22-23]. A migração de diversos tipos célulares, tais como os queratinócitos e fibroblastos da derme, representam, igualmente, passos fulcrais à correcta produção do tecido de granulação e posterior reorganização em tecido cutâneo regenerado. Neste trabalho a acção parácrina das células estaminais mesenquimatosas foi avaliada a partir de um concentrado de meio de cultura que teve em contacto com células estaminais mesenquimatosas isoladas a partir da matriz do cordão umbilical ou, alternativamente, da medula óssea, como referência. Este concentrado, daqui em diante designado de “meio condicionado” foi testado em células cultivadas in vitro e também in vivo em dois modelos animais. O meio condicionado foi obtido após uma sucessão de passagens a concentrações descrescentes de soro, de modo a obter um meio condicionado com baixa quantidade de proteínas do soro, e uma maior percentagem de proteínas secretadas pelas células estaminais mesenquimatosas em cultura. Foi obtido meio condicionado a partir de culturas de células estaminais mesenquimatosas isoladas a partir da matriz do cordão umbilical: i) em crescimento em meio suplementado com 2% de soro bovino fetal (FBS) e ii) confluentes em meio suplementado com 0% e 2% de FBS. Foi igualmente preparado meio condicionado a partir de culturas de células estaminais mesenquimatosas isoladas da medula óssea em crescimento em meio suplementado com 2% de FBS. Meio suplementado com 0% e 2% de FBS que não esteve em contacto com células em cultura foi usado como controlo. Todos os meios condicionados foram posteriormente concentradas em concentradores de proteína, quantificadas e sujeitas a uma electroforese num gel desnaturante de poliacrilamida de modo a permitir uma comparação do perfil proteico das amostras. Por forma a estudar o efeito dos diversos meios condicionados na migração celular foi realizado o ensaio in vitro da ferida, que avalia a capacidade de migração de diferentes tipos de células após contacto com um determinado composto. Este ensaio consiste em efectuar um risco de ≈0,5mm numa monocamada de células, que provoca a interrupção de ligações célula-a-célula e induz assim a migração das células no bordo do risco de modo a criar novos contactos célula-a-célula [24]. Neste sentido, e admitindo que as células estaminais mesenquimatosas secretam factores tróficos favoráveis à regeneração de uma lesão, é de esperar que a migração celular seja tanto maior quanto maior for a concentração de meio condicionado utilizada no ensaio. Tendo em consideração o papel fundamental dos queratinócitos e fibroblastos da derme na regeneração de feridas cutâneas, o ensaio in vitro da ferida foi realizado em culturas primárias humanas de fibroblastos da derme e na linha celular HaCaT de queratinócitos humanos. Os resultados obtidos demonstraram que a migração das células é, de facto, dependente da concentração de proteína no meio. Os resultados mais promissores foram obtidos com a linha HaCaT possivelmente devido à natureza de crescimento lento destas células que permite avaliar melhor a migração celular sem que esta seja confundida com crescimento celular. Foi também possível ver que os meios condicionados obtidos a partir de células estaminais mesenquimatosas em crescimento induziam uma maior migração do que os meios condicionados obtidos a partir de células confluentes. O efeito dos factores tróficos dos meios condicionados foram de seguida testados em modelos animais com o ensaio in vivo da ferida, que consiste na remoção das camadas epiderme e derme de uma secção da pele que é posteriormente tratado com um composto. A velocidade de fecho da ferida e a qualidade do tecido regenerado são indicadores do efeito benéfico do composto na regeneração da pele. Este efeito é avaliado por observação macroscópica da dimensão da ferida e microscópica de cortes histológicas das feridas. O primeiro ensaio in vivo da ferida foi realizado no murganho, no Centro de Investigação de Patobiologia Molecular, onde foram testados os diversos tipos de meios condicionados administradas por injecção sub-cutânea no local da ferida durante 10 dias. Os resultados demonstram, mais uma vez, que os meios condicionados obtidos a partir de células estaminais mesenquimatosas em crescimento induzem uma regeneração mais acelerada em comparação com os controlos aos dias 3 e 7. Os resultados permitem assim confirmar o efeito benéfico do meio condicionado que é dependente dos factores tróficos secretados pelas células estaminais mesenquimatosas. Apesar das vantagens da utilização do modelo murganho, nomeadamente a acessibilidade, fácil manuseio e baixo custo, o seu uso no model in vivo da ferida não é ideal devido à sua forma característica de cicatrização cutâneo que se processa de forma muito diferente dos humanos. Deste modo, em colaboração com o Centro de Estudos em Ciência Animal de ICETA da Universidade do Porto, foi desenvolvido um novo modelo in vivo para o ensaio da ferida, o modelo ovino. O ensaio preliminar no novo modelo ovino teve por objectivo identificar pontos cruciais do procedimento, nomeadamente o tipo de ferida (Ex.: de incisão ou excisão) a efectuar, o suporte físico (matriz) para a aplicação das amostras, a concentração das amostras e também o tipo de penso de protecção utilizado. Pontos estes que devem ser optimizados de forma a obter resultados proporcionais à acção do meio condicionado e das células. Neste primeiro ensaio preliminar foram ainda testados o meio condicionado obtido a partir de células estaminais mesenquimatosas em fase de crescimento; e células estaminais mesenquimatosas aplicadas directamente na ferida de tipo excisão. Para todos os grupos a testar, bem como os seus controlos, a aplicação foi tópica e exequível pela adição uma matriz de carboximetil celulose às amostras que aumentou a viscosidade destas. O desenvolvimento do processo e a análise do tamanho da ferida foi monitorizado ao longo dos 13 dias. Neste ensaio preliminar foi visto que a matriz de carboximetil celulose provocou uma reacção granulocítica local, o que retardou os efeitos benéficos do meio condicionado e das células. Esta manifestação de incompatibilidade ao carboximetil celulose realça a importância do veículo utilizado para a aplicação tópica e a necessidade desta ser um composto inerte e de fácil absorção pelas células. Por fim, a utilização de pensos absorventes para a protecção da ferida aberta mostrou também ser uma possível fonte de erro, que devido à sua natureza absorvente, possívelmente limitou a quantidade de proteína em contacto directo com a ferida. Neste sentido, num trabalho futuro pretende-se avaliar outras matrizes (Ex.: FloSeal), pensos e concentrações das amostras. Os resultados aqui apresentados vão de encontro ao descrito por outros autores, que sugerem um papel parácrino essencial das células estaminais mesenquimatosas na correcta e rápida regeneração de lesões cutâneas. É também interessante verificar que as células estaminais mesenquimatosas isoladas a partir da matriz do cordão umbilical, em particular, demonstaram ter uma potencial aplicação terapêutica visto que estas apresentam inúmeras vantagens em relação às células estaminais mesenquimatosas isoladas da medula óssea. Ao contrário da medula óssea, o cordão umbilical é um tecido rico em células estaminais mesenquimatosas, a sua colheita é não invasiva e está sujeito a menor variabilidade entre dadores. Finalmente, esta capacidade das células estaminais mesequimatosas de libertar inúmeros factores de crescimento e citocinas torna possível a perspectiva futura de uma terapêutica comercialmente disponível que permite uma rápida regeneração de lesões cutâneas perante uma simples aplicação tópica.
Description: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/6309
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