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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/6369

Título: Characterization of the subtilisin-like protease 3 in malaria parasites
Autor: Almeida, Mariana Justino Lage de
Orientador: Sinnis, Photini
Zilhão, Rita, 1959-
Palavras-chave: Malária
Plasmodium berghei
Plasmodium falciparum
Parasitas
Teses de mestrado - 2011
Issue Date: 2011
Resumo: Malaria is a huge global health threat, causing thousands of deaths and suffering every year, worldwide. Although there are some effective drugs available at present, the parasite often acquires resistance in the face of drug pressure. In order to choose the most efficient strategy to fight against this disease, it is imperative that we understand the basic biology of its causative agent Plasmodium. Plasmodium species express a number of proteases that have important roles in fundamental processes and, therefore, are potential drug targets. A number of serine proteases belonging to the subtilisin-like family, also named subtilases, have been identified in apicomplexan parasites like Toxoplasma, Neospora and Plasmodium. The Plasmodium genome has three subtilisin-like proteases. It has been shown in Plasmodium falciparum that the subtilisin-like proteases 1 (PfSub1) and 2 (PfSub2) have important roles in the invasion and egress of parasites from erythrocytes. However, little is known about subtilisin-like protease 3 (Sub3) in Plasmodium species. In this study, we used gene targeting to disrupt the sub3 gene in the rodent malaria parasite Plasmodium berghei ANKA and analyzed the effect of the deletion in the life cycle of the mutant. When mosquitoes were infected with the sub3 deletion mutants, we found no differences in the number of oocysts or salivary gland sporozoites compared to controls. We performed in vitro and in vivo experiments to further study the ability of the deletion mutants to establish infection in the mammalian host. Results show that recombinant parasites are able to normally infect and develop in the liver and blood. In consequence, deletion of sub3 gene did not impair or significantly affected parasite development in its natural hosts.
Estima-se que em 2009, metade da população mundial se encontrava em risco de contrair malária. Recentes estatísticas mostram que, no mesmo ano, aproximadamente 800 000 seres humanos morreram. Esta é uma doença que atinge maioritariamente os países em desenvolvimento do continente africano, asiático e sul-americano. A malária, ou paludismo, é causada por parasitas do género Plasmodium, pertencente ao filo Apicomplexa. A este filo pertencem vários parasitas eucariotas unicelulares com importante relevância médica, como é o caso dos géneros Crisptosporidium e Toxoplasma. As espécies de Plasmodium apresentam um ciclo de vida complexo que requer dois hospedeiros: o mamífero, onde apenas ocorre reprodução assexuada, e o vector invertebrado, onde adicionalmente há recombinação genética. O ciclo inicia-se quando o mosquito fêmea Anopheles tem uma refeição de sangue, ao picar a pele do hospedeiro, e inocula na derme parasitas sob a forma de esporozoítos. Seguidamente, os esporozoítos entram na corrente sanguínea, chegando ao fígado onde iniciam o seu desenvolvimento nos hepatócitos. Apesar de esta fase ser assintomática, os parasitas multiplicam-se assexuadamente originando milhares de parasitas denominados merozoítos que, quando libertados no sangue, são capazes de invadir eritrócitos. Nos eritrócitos o parasita inicia a fase seguinte do seu desenvolvimento, passando por sucessivos estádios de maturação que culminam na libertação de novos merozoítos. Ao fim de vários ciclos de multiplicação no sangue, alguns merozoítos diferenciam-se em formas sexuais – os gametócitos –, que são ingeridos durante a refeição de sangue do mosquito dando início à fase sexuada do ciclo de vida. Após recombinação no vector, o parasita começa uma nova fase de reprodução assexuada originando milhares de esporozoítos, que migram do intestino para as glândulas salivares do mosquito. Numa próxima refeição, os esporozoítos são inoculados na pele do hospedeito dando início a um novo ciclo. A elevada morbilidade e mortalidade da malária torna a sua erradicação uma das principais prioridades da Organização Mundial de Saúde. Durante décadas, têm sido feitos inúmeros esforços com o intuito de erradicar a doença. Há cinquenta anos atrás, a malária foi eliminada em muitas áreas do planeta, através do uso de drogas como a cloroquina. No entanto, devido ao desenvolvimento de resistência por parte do parasita, a incidência da doença aumentou novamente. Recentemente têm sido utilizadas novas e eficientes drogas como a artemisina. Infelizmente, foram identificados recentemente casos de resistência à artemisina. Se este fenómeno se alastrar, as consequências podem ser devastadoras e, por essa razão, é extremamente importante que novos compostos e alvos sejam descobertos. As proteases do parasita da malária apresentam um enorme potencial como alvos de novos compostos devido ao papel crucial que desempenham em várias fases fundamentais à continuidade do ciclo de vida. As subtilases pertencem à grande família das proteases de serina e caracterizam-se pela ordem onde se localizam os resíduos que compõe o seu centro activo: Asp – His – Ser. Em P. falciparum são conhecidas três subtilases: subtilase 1, 2 e 3. Enquanto que Sub1 está envolvida na via proteolítica que induz a saída dos merozoítos dos eritrócitos, a Sub2 está implicada na invasão dos mesmos. O presente trabalho focou-se particularmente numa protease sobre a qual não existem quaisquer estudos funcionais – a subtilase 3 (Sub3). Para melhor compreender o papel da Sub3 no parasita, o nosso trabalho foi dividido em duas etapas: o estudo do padrão de expressão do gene sub3 e a caracterização de um parasita com uma deleção no mesmo gene. Todas as experiências foram realizadas em P.berghei, um parasita de roedores reconhecido como um modelo válido para a investigação experimental em malária. A expressão de sub3 foi analisada em esporozoítos no intestino e glândulas salivares do mosquito, bem como em parasitas presentes no sangue de ratinhos infectados. A presença de RNA mensageiro de sub3 foi detectada em esporozoítos no intestino do mosquito, com resultados reprodutíveis em todas as experiências realizadas. No entanto, os resultados obtidos nos restantes estádios analisados não foram igualmente consistentes. O parasita mutante, gerado por recombinação homóloga, contém uma deleção no gene que codifica a subtilase 3. A região delectada no locus recombinante inclui o codão de iniciação da tradução, os resíduos de histidina e serina do centro activo e parte da região codificante. O primeiro passo na análise da população de mutantes, também denominados parasitas sub3Δ, foi a infecção de mosquitos Anopheles fêmea. Um defeito nesta fase do ciclo pode significar um bloqueio na transmissão do parasita. Contudo, os vários ensaios experimentais mostraram que o desenvolvimento do parasita recombinante ocorre de forma normal no vector, culminando com a presença de esporozoítos nas glândulas salivares do mosquito. O sucesso da infecção no vector prova, ainda, que os gametócitos previamente ingeridos pelo mosquito estão funcionalmente activos. Em seguida, avaliámos a mobilidade dos esporozoítos sub3Δ. Se esta propriedade for afectada, os parasitas serão menos eficientes a migrar do local de inoculação para os vasos sanguíneos originando, potencialmente, um parasita com menor probabilidade de continuar o seu percurso. Para analisar a capacidade de locomoção dos mutantes realizámos experiências in vitro e in vivo. Quando depositados numa superfície de vidro, os esporozoítos recombinantes revelam uma ligeira diminuição na sua mobilidade. Contudo, quando em contacto com uma monocamada de hepatócitos, os esporozoítos sub3Δ atravessam as células com igual eficiência relativamente aos parasitas controlo. Um resultado similar foi obtido in vivo: após inoculação na derme de ratinhos, os esporozoítos sub3Δ chegam ao fígado com sucesso e sem atraso relativamente aos controlos. Em conjunto, os resultados indicam que a via natural de infecção do parasita não foi afectada. Posteriormente analisámos a fase hepática do ciclo de vida. Tal como foi descrito anteriormente para o estudo da locomoção, o desenvolvimento do parasita sub3Δ no fígado foi analisado in vitro e in vivo. Ambos os ensaios demonstram que a multiplicação de parasitas sub3Δ durante a fase hepática ocorre tal como é esperado em parasitas wild type. Em suma, os resultados apresentados mostram que apesar de RNA mensageiro de sub3 ser detectado nos parasitas, a deleção de sub3 não afecta o progresso do parasita recombinante ao longo do ciclo de vida. Curiosamente, ao contrário do observado para as subtilases 1 e 2, não foram detectadas diferenças fenótipicas, nas fases do desenvolvimento analisadas, entre o parasita mutante gerado para estudar a subtilase 3 e os parasitas wild type, tornando difícil compreender o papel desta protease no parasita.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/6369
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