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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/6389

Title: Development of a cellular model of oculopharyngeal muscular dystrophy
Authors: Calado, Patrícia Ramalhete Mendes da Silva, 1974-
Advisor: Fonseca, M. Carmo, 1959-
Keywords: Células
Distrofia muscular oculofaríngea
Patologia
Fisiologia
Teses de doutoramento - 2007
Issue Date: 2006
Abstract: A significant number of debilitating human diseases are associated with the deposition of protein aggregates. These include Alzheimer’s disease, Huntington’s disease and Parkinson’s disease, among others. Under pathological conditions, proteins or peptides that are abnormally soluble undergo aggregation and generate stable insoluble fibers that accumulate in a variety of organs. Oculopharyngeal Muscular Dystrophy (OPMD; OMIM 164300) is a dominant late-onset disease, characterized by progressive ptosis, dysphagia and proximal limb weakness. The OPMD mutation consists of short expansions of a (GCN)10 repeat coding for a polyalanine tract at the N-terminus of the polly(A)-binding protein nuclear 1 (PABPN1) (Brais et al., 1998). This results in an alanine-expanded form of PABPN1, which aggregates and forms dense, insoluble intranuclear inclusion bodies in skeletal muscle of OPMD patients. PABPN1 is ubiquitously expressed and is involved in poly(A) tail synthesis and poly(A) tail length control (Kuhn and Wahle, 2004). The molecular mechanisms leading from PABPN1 mutation to OPMD phenotype and the role of aggregate formation in the progression of the disease are poorly understood. In the present study we proposed to contribute to the understanding of OPMD pathophysiology. Our first goal was to elucidate the mechanisms involved in the formation of OPMD nuclear inclusions. We developed a cellular model of PABPN1 aggregation based on the exogenous over-expression of different protein variants in both HeLa and myogenic C2 cells. We were able to show that normal PABPN1 is inherently aggregation-prone when overexpressed. The formation of insoluble aggregates was observed upon expression of PABPN1 variants containing either a polyalanine expansion or a complete deletion of the polyalanine tract, indicating that the OPMD-causing mutation is not essential for the formation of inclusions. Conversely, PABPN1 variants containing deletions or point mutations in any of the domains involved in PABPN1 function in polyadenylation fail to form aggregates, strongly suggesting that the in vivo aggregation of PABN1 is tightly coupled to its function in polyadenylation. We monitored the dynamics of PABPN1 interactions within the inclusions by photobleaching analysis and observed that both normal and alanine-expanded PABPN1 molecules are not irreversibly sequestered into aggregates, they are in constant Exchange between the inclusions and the nucleoplasm. Taken together, these observations raise serious questions concerning OPMD models based on the over-expression of PABPN1 and argue against a pathological role of the aggregates by the irreversible trapping of other nuclear components. Our next goal was to identify mechanisms of cellular dysfunction underlying OPMD. We developed a cellular model of the disease based on the stable expression of normal (10 alanines) and mutant (17 alanines) PABN1 in myogenic C2 cells. Gene expression profiling of our cellular model identified Evi3 as a consistently up-regulated gene in muscle cells expressing mutant PABPN1. The human homolog to mouse Evi3, ZNF521, encodes a transcription factor which is known to interact with Smad proteins and to participate in BMPdependent transcriptional activation (Bond et al., 2004). We tested the BMP-dependent transcription of a reporter gene in our cellular model of OPMD. Whereas cell lines expressing normal PABPN1 displayed strong transcriptional activation in response to BMP, cell lines expressing mutant PABPN1 failed to activate transcription of this BMP-responsive element. The differential expression of the human homolog to Evi3 was validated in primary muscle cell lines derived from OPMD patients. Analysis of ZNF521 mRNA levels in OPMD and control sternocleidomastoideus muscle corroborated the up-regulation observed in the celular model. In contrast, we observed a down-regulation of ZNF521 mRNA in cricopharyngeus muscle from OPMD patients when compared to control. This controversial result may reflect the specificity of the cricopharyngeal muscle, which renders it more susceptible to OPMD dysfunction. Morphological mitochondrial abnormalities in OPMD muscle biopsies were reported several times (Julien et al., 1974; Pauzner et al., 1991; Pratt and Meyers, 1986; Wonget al., 1996) but tended to be considered as a non-specific secondary phenomenon of the disease. We proposed to address the role of mitochondrial dysfunction in OPMD through the evaluation of mitochondrial alterations in muscle biopsies from patients and in the celular model of the disease. We found that muscle biopsies from OPMD patients display na increased number of cytochrome c oxidase (COX)-negative fibers when compared to similarly aged controls. In addition, analysis of our cellular model revealed that cell lines. expressing mutant PABPN1 produce higher protein levels of the 39 kDa subunit from the.mitochondrial respiratory chain complex I. Although requiring further investigation, these.results are indicative of a role for mitochondrial dysfunction in the progression of OPMD. In summary, our work produced important information concerning the role of PABPN1 aggregates in OPMD. In addition, we identified altered BMP-dependent transcription as a candidate mechanism for OPMD pathology. Finally, we provided evidence that mitochondrial alterations may contribute to the disease phenotype. Hopefully, the further investigation of these lines of work will prove valuable to the full understanding of OPMD pathophysiology.
A formação de agregados proteicos é uma característica patológica de um número.crescente de doenças humanas. Estas grupo de patologias tem um impacto social dramático, já que inclui, entre muitas outras, a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a doença de Huntington. A grande maioria é causada por mutações que originam proteínas anómalas, com uma conformação aberrante que lhes confere uma elevada tendência para se depositarem soba forma de agregados (Carrell and Lomas, 1997). São, por isso, geralmente designadas de doenças “conformacionais”. A designação destes depósitos proteicos é variável, sendo utilizados os termos agregados, inclusões ou placas, entre outros (Wojcik and DeMartino, 2003). A formação de agregados pode ocorrer em diferentes compartimentos celulares, ou mesmo ser extracelular. As proteínas mutadas nas diferentes doenças não têm semelhanças óbvias entre si em temos de dimensão, composição em aminoácidos, sequência ou estrutura. No entanto, várias evidências sugerem que a formação dos diferentes tipos de agregados ocorre através de mecanismos comuns e que induz uma resposta celular semelhante. Uma dessas evidências é a natureza fibrilhar dos agregados, que apresentam um motivo estruturarico em folhas β (Ross and Poirier, 2004). Outra das características comuns às diferentes doenças “conformacionais” é a presença, nos agregados, de componentes dos sistemas de vigilância celular, nomeadamente, cadeias de ubiquitina, sub-unidades do proteassoma e chaperones moleculares (Ross and Poirier, 2004). Estas semelhanças sugerem a ocorrência de mecanismos de patogénese comuns às várias doenças onde se verifica a formação de agregados proteicos. A descoberta de agregados num grupo alargado de doenças levou rapidamente à conclusão de que seriam os próprios agregados os responsáveis pela toxicidade celular. De facto, em algumas patologias, como a amiloidose sistémica, o volume de agregados depositado extracelularmente assume um papel patológico preponderante, levando à falência de órgãos (Pepys, 2006). No entanto, o papel dos agregados intracelulares, característicos sobretudo de doenças neurodegenerativas, tem sido amplamente debatido. Uma relação causal entre a presença de agregados e a toxicidade celular é fortemente contestada por vários estudos que revelaram que, em doentes com Huntington, as células com maior quantidade de agregados não são as mais afectadas. (Gutekunst et al., 1999), e que a densidade total de agregados não se correlaciona com a severidade clínica em doentes com Parkinson (Tompkins and Hill, 1997) nem com Alzheimer (Braak and Braak, 1991; Price and Morris, 1999; Terry et al., 1991). Apesar destas evidências contra um papel patológico dos agregados, verifica-se uma forte correlação entre a tendência das proteínas mutadas para agregar e a severidade da doença (Davies et al., 1997), fortemente sugestivo de que o processo de agregação per se tóxico. Este aparente paradoxo encontra explicação na natureza progressiva da agregação. Os agregados, visíveis ao microscópio, representam o culminar de um processo de agregação faseado, envolvendo vários tipos de intermediários. Os eventos iniciais no processo de agregação podem constituir o componente tóxico deste processo. A visão actual é a de que a formação de agregados reflecte um mecanismo de defesa celular com o objectivo de concentrar e/ou eliminar as espécies intermédias, tóxicas. Estas espécies tóxicas podem corresponder aos monómeros da proteína mutada ou a qualquer uma de várias estruturas intermediárias já descritas, como pequenos oligómeros, estruturas em forma de poro e protofibrilhas (Conway et al., 2000; Harper et al., 1997b; Lashuel et al., 1998; Poirier et al., 2002; Walsh et al., 1997). Vários mecanismos têm sido sugeridos para explicar a toxicidade celular nas doenças “conformacionais”. Uma das hipóteses é a de que a célula tenta eliminar a proteína mutada através da via ubiquitina-proteassoma, resultando na saturação do sistema e consequente disfunção celular (Berke and Paulson, 2003). Outro dos mecanismos propostos é a alteração da transcrição génica, devido à interacção aberrante das proteínas mutadas com factores de transcrição (Sugars and Rubinsztein, 2003). Também a disfunção mitocondrial e/ou o stress oxidativo parecem contribuir para a disfunção celular observada nas doenças “conformacionais” (Beal, 2005). Uma característica comum a este grupo de patologias é o longo período de tempo que precede a ocorrência dos primeiros sintomas. Embora variável de doença para doença, e mesmo entre casos da mesma doença, a maioria destas patologias manifesta-se apenas a partir da quarta ou quinta década de vida. A eficácia dos sistemas de vigilância celulares sofre uma redução significativa com o envelhecimento (Carrard et al., 2002; Keller et al., 2002; Shamovsky and Gershon, 2004; Soti and Csermely, 2003); por outro lado, a disfunção mitocondrial e a produção de espécies oxidativas é substancialmente agravada com a idade (Beal, 2005). A toxicidade celular subjacente às doenças “conformacionais” apresenta-se assim, não como resultado de um processo único, mas como o somatório de vários mecanismos patológicos potenciados, a determinada altura, pela degenerescência celular inerente ao envelhecimento. A Distrofia Muscular Oculofaríngea (Oculopharingeal Muscular Dystrophy – OPMD,OMIM 164300) é uma doença de distribuição mundial, de manifestação tardia e transmitida de forma autossómica dominante (Victor et al., 1962). Os sintomas mais característicos da.OPMD são a ptose palpebral, a disfagia e a miopatia proximal. Do ponto de vista anatomopatológico,a OPMD caracteriza-se pela presença de inclusões intranucleares no músculo esquelético (Tome and Fardeau, 1980). Estas inclusões são formadas por filamentos de aspecto tubular, com um diâmetro interior de 3 nm, exterior de 8.5 nm, e um comprimento máximo de 0.250 μm, que se dispõem em forma de paliçada. O gene responsável pela OPMD localiza-se no cromossoma 14q11.1 e codifica para a proteína poly(A)-binding protein nuclear 1 (PABPN1). A mutação responsável pela OPMD consiste numa expansão de trinucleótidos (GCN), que tem como consequência o aumento de uma faixa de alaninas localizada na extremidade amina da proteína PABPN1 (Brais et al., 1998). A proteína PABPN1 normal possui uma sequência de dez alaninas, enquanto que nos doentes OPMD esta faixa se encontra expandida, contendo entre 12 e 17 alaninas. As inclusões intranucleares são compostas por PABN1 e acumulam RNA-poli(A), ubiquitina, componentes do proteassoma (Calado et al., 2000b) e chaperones moleculares (Bao et al., 2002). A PABPN1 é uma proteína nuclear, de expressão ubiquitária, que se liga às caudas nascentes de poli(A) no pré-mRNA, estimulando a sua extensão e controlando o seu comprimento (Wahle, 1991a). Os 306 aminoácidos que constituem a PABPN1 caracterizam-se por uma extremidade amina que contém a faixa de alaninas e uma região rica em glutamatos, um domínio em hélice α essencial à poliadenilação e um domínio de ligação ao mRNA na região central, e uma extremidade carboxílica rica em argininas e necessária para a ligação ao mRNA (Kuhn and Wahle, 2004). A expansão de alaninas na extremidade amina da proteína PABPN1 ocorre, assim, fora dos domínios envolvidos na poliadenilação, sugerindo que a função da proteína na poliadenilação não é afectada. De facto, as moléculas de mRNA sintetizadas nas fibras musculares de doentes OPMD apresentam uma dimensão de caudas poli (A) normal (Calado et al., 2000b).O mecanismo molecular através do qual a PABPN1 mutada provoca doença e o envolvimento preferencial de células musculares nesta patologia, nomeadamente dos músculos extraoculares e faríngeos, não está esclarecido. Este trabalho teve como objectivo contribuir para a clarificação da patofisiologia de OPMD. Numa primeira abordagem, propusemo-nos clarificar o processo de agregação in vivo da proteína PABPN1. Para este efeito, desenvolvemos um modelo celular de agregação, através da expressão transitória de variantes da PABPN1 em células HeLa e em células miogénicas C2. Pudemos observar que a proteína PABPN1 normal tem uma grande tendência para agregar in vivo e que a sua sobre-expressão induz a formação de agregados com características bioquímicas semelhantes às das inclusões de OPMD. Assim, verificámos que a formação de agregados não é dependente da expansão de alaninas causadora de OPMD. Mais ainda, a sobre-expressão de uma variante de PABPN1 contendo uma delecção total da faixa de alaninas induz igualmente o aparecimento de inclusões, dissociando de forma inequívoca a capacidade de agregação e o domínio de alaninas. Pelo contrário, a interferência com qualquer dos domínios da PABPN1 necessários ao processo de poliadenilação, inibe a formação de agregados. A associação entre a função da PABPN1 na poliadenilação e o seu processo de agregação foi ainda reforçada pela identificação de um novo componente recrutado pelos agregados, a polimerase de poli(A). Estes resultados sugerem que as interacções mediadas por.domínios proteicos independentes da faixa de polialaninas podem ser determinantes no processo patológico. Por outro lado, os dados obtidos comprometem seriamente a utilização de modelos celulares de OPMD baseados na expressão exógena de PABN1. Um dos mecanismos de toxicidade propostos para as doenças “conformacionais” é o sequestro pelos agregados de componentes celulares essenciais. Os agregados funcionariam assim como armadilhas moleculares, estruturas estáticas, capazes de concentrar permanentemente outros componentes. A análise do nosso modelo de agregação revelou que as moléculas de PABN1 não estão irreversivelmente sequestradas nos agregados; pelo contrário estão em movimento.constante, entre o nucleoplasma e as inclusões. Estes dados indicam que os agregados são.estruturas dinâmicas e contestam fortemente a hipótese de que o sequestro definitivo de.componentes celulares por estas estruturas seja um mecanismo de toxicidade em OPMD. O objectivo seguinte a que nos propusemos foi o de identificar mecanismos moleculares subjacentes à OPMD. Para este efeito, desenvolvemos um modelo celular da doença através da geração de linhas celulares miogénicas com expressão estável de PABPN1normal (10 alaninas) ou mutada (17 alaninas). Este modelo celular de OPMD foi submetido a uma análise de expressão genética por microarrays, com vista a identificar genes com expressão diferencial. Identificámos o gene Evi3 sistematicamente sobre-expresso nas linhas celulares a expressar PABPN1 mutada. O homólogo humano do gene Evi3 codifica um factor de transcrição que participa na via de sinalização intracelular mediada por proteínas Smad, em resposta à activação por bone morphogenetic protein (BMP) (Bond et al., 2004). Assumindo uma função da proteína Evi3 na sinalização BMP, realizámos um ensaio funcional utilizando.um gene repórter. A transcrição deste repórter ocorre quando existe activação de uma sequência regulatória dependente da estimulação celular por BMP. Enquanto que linhas celulares que expressam PABPN1 normal apresentaram uma forte activação da transcrição do.gene repórter em resposta à estimulação por BMP, nas linhas que expressam PABPN1 mutada.não se registou um aumento da transcrição do gene repórter após a suplementação das células com BMP. Esta deficiente activação de uma sequência regulatória dependente de BMP constitui uma indicação de que a patofisiologia molecular da OPMD pode incluir alterações na transcrição de genes dependentes da sinalização BMP. A expressão diferencial de Evi3 foi seguidamente validada em linhas musculares primárias de doentes de OPMD e respectivos controlos. O envolvimento preferencial de músculos craniofaciais, nomeadamente os extraoculares e os faríngeos é uma característica da OPMD. No entanto, músculos do tronco também podem ser afectados, mesmo até como primeira manifestação da doença (Van Der Sluijs et al., 2003a). Assim, o nível de mRNA de.ZNF521, o homólogo humano de Evi3, foi comparado, não só entre doentes e controlos, mas também entre os músculos cricofaríngeo e o esternocleidomastoideu. O nível de expressão de mRNA de ZNF521 em miotubos resultantes do músculo esternocleidomastoideu de um doente OPMD revelou-se duas vezes superior ao nível de expressão em miotubos de músculo esternocleidomastoideu controlo. Este resultado confirmou os dados obtidos através da análise,do modelo celular de OPMD, em que o mRNA de Evi3 se encontrava sobre-expresso em linhas celulares a expressar PABPN1 mutada. A análise dos níveis de mRNA de ZNF521 em miotubos resultantes de músculo cricofaríngeo produziu um resultado surpreedente, já que foi verificada uma variação, mas de tendência inversa à anterior. A expressão de mRNA de ZNF521 em miotubos de cricofaríngeo provenientes de dois doentes de OPMD está significativamente diminuída em relação ao controlo. Este resultado controverso é provavelmente um reflexo da natureza particular dos músculos craniofaciais relativamente aos músculos do tronco (Mootoosamy and Dietrich, 2002). Aparentemente, a expressão de ZNF521 encontra-se alterada tanto em músculos craniofaciais como em músculos do tronco de doentes de OPMD. No entanto, a variação ocorre em sentidos opostos consoante o tipo muscular. Uma vez que o nosso modelo de OPMD recorre à utilização de uma linha celular murina derivada de músculo da perna (linha C2) (Yaffe and Saxel, 1977), justifica-se que a sobre-expressão de Evi3 verificada nas linhas a expressar PABPN1 mutada encontre paralelo na sobre-expressão de ZNF521 em músculo esternocleidomastoideu de doentes de OPMD. No futuro, será essencial determinar quais as consequências funcionais do aumento e da diminuição da expressão de ZNF521 em músculo esternocleidomastoideu e cricofaríngeo, respectivamente, de doentes de OPMD. Vários estudos descrevem a ocorrência de alterações morfológicas em mitocôndrias de biópsias de doentes de OPMD (Julien et al., 1974; Pauzner et al., 1991; Schroder et al., 1995; Wong et al., 1996). Estas alterações tendem a ser consideradas como um fenómeno secundário não específico da doença e até à data não existem dados que relacionem estas alterações mitocondriais com um defeito na capacidade bioenergética das células musculares dos doentes de OPMD. Propusemo-nos, assim, a clarificar a eventual existência de alterações mitocondriais na OPMD. Os resultados obtidos evidenciaram alterações tanto em músculo de doentes como no modelo celular da doença. A frequência de fibras musculares negativas para coloração de oxidase do citocromo c (COX) é superior em biópsias de doentes de OPMD, em comparação com controlos da mesma faixa etária. Esta observação sugere que a elevada frequência de fibras negativas para cox é uma característica histopatológica do músculo de doentes de OPMD. Adicionalmente, a análise do modelo celular revelou que as linhas celulares a expressar PABPN1 mutada contêm níveis proteicos mais elevados da subunidade de 39 kDa do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial. No entanto, a avaliação da actividade enzimática dos complexos da cadeia respiratória em músculo de doentes e no modelo celular de OPMD não revelou alterações. Embora sejam necessários mais estudos no sentido de compreender a relevância fisiológica das alterações encontradas, os resultados obtidos sugerem que a disfunção mitocondrial pode contribuir para o fenótipo da OPMD. Assim, o trabalho realizado representa um contributo para a compreensão dos mecanismos responsáveis pela OPMD. Em primeiro lugar, estabelecemos uma associação entre a função da PABN1 na poliadenilação e a formação de agregados, salientando a importância das interacções mediadas por domínios da proteína independentes da expansão de polialaninas. Caracterizámos a dinâmica molecular dos agregados, demonstrando que as moléculas de PABPN1 estão em constante movimento de entrada e saída dos agregados, não.sendo por isso provável que estas estruturas representem locais de sequestro de outros.componentes nucleares. Identificámos também alterações na transcrição dependente de BMP e propomos que este seja um mecanismo de patogénese em OPMD. Finalmente, relançamos a hipótese de que as alterações mitocondriais contribuam para a disfunção muscular observada na OPMD. Esperamos que esta informação possa ser utilizada na criação de novas linhas de investigação, na esperança de que se reúna o conhecimento suficiente de modo a permitir o desenvolvimento de estratégias terapêuticas aplicáveis à OPMD. Tendo em conta o elevado número de doenças caracterizadas pela agregação de proteínas mutadas, a clarificação dos mecanismos da OPMD pode ainda contribuir para a compreensão de um conjunto de doenças mais vasto e de grande impacto social.
Description: Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2007
URI: http://hdl.handle.net/10451/6389
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