Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/6401
Título: β-amyloid-dependent neuronal dysfunction and effect on the endocytic pathway
Outros títulos: Disfunção neuronal dependente de β-amilóide e o efeito na via endócitica
Autor: Almeida, Cláudia Guimas de, 1976-
Orientador: Mendonça, Alexandre de, 1958-
Palavras-chave: Amilóide
Beta-amilase
Doença de Alzheimer
Proteínas tau
Proteína Beta amilóide
Neurofibrilares
Teses de doutoramento - 2007
Data de Defesa: 2007
Resumo: Alzheimer’s disease (AD) is a major disease of aging affecting about 10% of the elderly population, is the leading cause of dementia and a major health care concern. AD patients develop a gradual and progressive decline in cognitive and functional abilities as well as behavioral and psychiatric symptoms, eventually leading to a vegetative state and ultimately death. In 1907, Dr. Alois Alzheimer published the first report linking the clinical features of AD to plaque and tangle neuropathology. Neurofibrillary tangles in the brain consist primarily of hyperphosphorylated tau. Neuritic plaques consist primarily of aggregated amyloid β (Aβ) peptides and are surrounded by dystrophic neurites, microglia, and reactive astrocytes. Plaques are increasingly viewed as tombstones, and do not correlate well with cognitive impairment. The progressive accumulation of soluble β-amyloid (Aβ) in vulnerable brain areas with aging does parallel the progressive dementia found in AD patients. Plaques are not considered to be responsible for the initial impairments. Therefore, reduction of Aβ is currently the leading approach of experimental therapies for AD. Purification and sequencing of Aβ from AD brain led to the cloning of the amyloid precursor protein (APP) gene and triggered research on trying to understand how the age-dependent accumulation of Aβ in the brain leads to the downstream pathologies and progressive dementia. Aβ is generated by two sequential cleavages of APP by β- and γ-secretases, two major forms of Aβ are produced, a long one with 42 amino acids, Aβ42, and a shorter one with 40 amino acids, Aβ40. Aβ42 is more hydrophobic; it easily aggregates and associates to membranes, likely facilitating its retention intracellularly. Aβ40 is more soluble and is mostly secreted. In 1993, the first biochemical evidence for appreciable levels of endogenous intracellular Aβ was reported in vitro. In 2000, with the development of antibodies that differentiated Aβ42 peptide from its precursor, it was reported that Aβ42 accumulated intracellularly in neurons even before plaque formation. Since then, several studies have implicated the accumulation of Aβ within neurons as important for AD pathogenesis. Loss of synapses occurs early in AD and is considered the best pathological correlate of cognitive decline. Several lines of evidence suggest a relationship between Aβ accumulation and synaptic dysfunction. Depressed synaptic transmission, including impaired LTP (long-term potentiation), has been reported in AD mouse models of β- amyloidosis, and occurs concomitantly with the appearance of intraneuronal Aβ accumulation even prior to appearance of extracellular plaques. This observation suggests that the intracellular accumulation of Aβ42 may have an important role in AD pathogenesis, especially in the initial stages of the disease. Tg2576 mice harbor the human APP transgene with the familial AD Swedish mutation and develop AD-like cerebral amyloidosis. Aβ accumulates and oligomerizes within neurons of Tg2576 mice with aging in vivo, especially within neuronal processes and synaptic compartments. To study the cell biology of Aβ-dependent neuronal dysfunction, we turned to cultured neurons from Tg2576 mice. Tg2576 neurons were previously characterized to recapitulate the accumulation of Aβ with time in culture. We set out to better characterize the consequences of this aberrant Aβ42 accumulation on synapses. In this study, we found both structural and functional alterations in pre- and postsynaptic compartments in Tg2576 compared to wild-type neurons at 19 days in vitro (DIV). The presynaptic alterations included reductions in the number of active presynaptic compartments and in the levels of synaptophysin, a synaptic vesicle protein. The postsynaptic alterations included reductions in the levels of the glutamate receptor subunit, GluR1, and of the postsynaptic density protein, PSD-95. Since Aβ42 accumulation progresses with time in culture, at 19 DIV there is higher concentration of Aβ42 with more probability of aggregation and oligomerization than at 12 DIV. We hypothesized that the changes at 19 DIV could correspond to a more severe phenotype paralleling a later stage of disease. Therefore, we studied synapses at 12 DIV in Tg2576 compared to wild-type neurons. Presynaptically there was no difference in the number of active compartments or in the levels of synaptophysin however, postsynaptically spines were reduced. Specifically, the postsynaptic changes included reduction in the levels of PSD-95 and of glutamate receptors subunits GluR1 and NR1 at the postsynaptic density but not in total cellular lysates. These results suggest that early on the alterations at synapses are due to an impaired trafficking of glutamate receptors. The glutamate receptors are critical determinants for LTP and long-term depression (LTD), forms of synaptic plasticity thought to be involved in the establishment of new memories. Our results shed light on the consequences of Aβ acumulation on synapses, specifically on the earliest alterations that lead to synaptic dysfunction and cognitive decline in AD. However, although we found Aβ42 to be responsible for the synaptic alterations in Tg2576 neurons, the mechanism whereby Aβ42 affects synapses needs further clarification. Over the past few years, increasing evidence supports that intraneuronal Aβ accumulation is involved in early AD pathogenesis. Although the precise location(s) of Aβ production in neurons remains controversial, the subcellular site of Aβ42 accumulation in AD is better accepted. Aβ42 accumulation in the brains of Tg2576 mice and human AD occurs especially in multivesicular endosomes (MVBs). Alterations in the endocytic pathway are among the earliest pathological changes in AD. The molecular mechanisms by which abnormalities in the endocytic pathway arise and are involved in the pathogenesis of AD remain unknown. In the brain, Aβ42- accumulating MVBs often localize close to degenerating synapses. Since Aβ42 accumulation with aging occurs in the outer limiting membranes of MVBs, we hypothesized that this accumulation could alter the MVB sorting pathway in neurons. MVBs are vesicular organelles morphologically defined by a limiting membrane and characteristic inner vesicles. MVBs are considered to be late endosomes, formed by maturation of early endosomes by membrane invaginations that generate inner vesicles with an acidic pH. The inner vesicles have a different content of lipids and proteins: they are rich in cholesterol, LBPA (lysobisphosphatidic acid) and lysosomal glycoproteins. MVBs are involved in many cellular functions, including the regulated trafficking of several proteins and membrane receptors. The trafficking of the epidermal growth factor receptor (EGFR) to MVBs has been the most extensively studied. EGFR upon stimulation with EGF is internalized into early endosomes. The EGF-EGFR complex is stable at the pH of early endosomes, and therefore the activated receptor follows the MVB pathway. During endosomal maturation, inward invagination of the outer membrane leads to MVB formation and traps receptors in the MVB interior, terminates signaling and promotes their subsequent degradation in the more acidic environment of inner vesicles of MVBs and lysosomes. In neurons, the functional role of MVBs is less well understood. MVBs are thought to have an important role in retrograde transport, carrying receptors from neuronal terminals to the cell body for signaling and/or degradation in lysosomes. For example, neurotrophin receptors after ligand binding are internalized presynaptically and transported in MVBs to the cell body where signaling to the nucleus can occur, thereby preventing the loss of signaling during transport. The sorting of neurotrophin receptors to MVBs has been described for TrkB, which upon brain derived neurotrophic factor (BDNF) activation is quickly removed from the cell surface by endocytosis and delivered to the MVB sorting pathway. Since Aβ42 accumulates especially in the outer limiting membrane of MVBs with AD pathogenesis, we postulated that this could impair MVB sorting. We set out to study the MVB sorting pathway in cultured Tg2576 neurons following the trafficking of EGFR after EGF binding, which is well characterized. We demonstrated that Aβ accumulating Tg2576 neurons revealed normal internalization and recycling but altered MVB sorting of EGFR upon activation. The accumulation of EGF-EGFR in MVBs of Tg2576 compared to wild-type neurons suggested reduced degradation of EGFR. We verified altered MVB sorting and degradation of another ligand-receptor complex, BDNF-TrkB, which provided similar results. To obtain more information on the trafficking of EGFR within MVBs, we assessed the levels of phosphorylated EGFR (P-EGFR), since dephosphorylation is thought to occur at the low pH of the inner vesicles of MVBs, and found elevated P-EGFR in Tg2576 neurons. These data suggested impairment in the trafficking of EGFR within MVBs that accumulate Aβ42. Ubiquitination is required for trafficking of EGFR to MVBs, subsequent translocation within MVBs, and later degradation of EGFR via the MVB sorting pathway. It was therefore possible that reduced ubiquitination of EGFR might be blocking EGFR from translocating to inner MVB membranes. Instead, we found increased ubiquitin conjugated EGFR in Tg2576 neurons, suggesting that ubiquitination of EGFR was not impaired. Therefore, we hypothesized that deubiquitination activity might be compromised. Analysis of deubiquitinating enzyme activity did reveal reduced deubiquitination in Tg2576 neurons, although the modest change seemed insufficient for the more marked elevation in ubiquitinated EGFR. Considerable evidence over the past few years has indicated that the ubiquitinproteasome system (UPS) regulates the trafficking of EGFR through the MVB sorting pathway. Proteasome activity has been described to be necessary for deubiquitination to occur prior to EGFR translocation, also since proteasome inhibition leads to decreased EGFR degradation. Therefore, we next examined proteasome activity in Tg2576 compared to wild-type neurons, which revealed a marked reduction in proteasome activity in Tg2576 neurons. Since proteasome inhibition also inhibits deubiquitination, reduced proteasome activity therefore could be responsible for the cellular alterations that we observed in the Tg2576 neurons. We provide evidence that Aβ is responsible for the alterations in the MVB sorting pathway and the UPS in Tg2576 neurons, since the inhibition of Aβ accumulation blocked the cellular alterations in Tg2576 neurons, including impairment in proteasome activity. Moreover, in support of Aβ-induced proteasome inhibition occurring in Tg2576 neurons, we found that proteasome inhibition of wild-type neurons produced alterations in the MVB sorting pathway paralleling those seen in Tg2576 neurons. The findings that the disease-linked Aβ42 peptides localize and accumulate especially in MVBs and thereby alter the trafficking of membrane receptors by inhibiting the UPS, suggest a mechanism whereby Aβ42 accumulation contributes to AD pathogenesis. The UPS is a complex system of interconnecting biochemical pathways that are increasingly being found to have major cellular functions even beyond the degradation of proteins. The UPS is being studied in the regulated recycling and degradation of membrane receptors and has been linked to the regulation of synaptic plasticity. Indeed, we hypothesize that the inhibition of the UPS by Aβ42 impairs the endocytic trafficking of neuronal receptors, and thereby may be the cause of synaptic dysfunction in AD. Our data supports a novel mechanism whereby Aβ accumulation alters the cell biology of vulnerable neurons in AD.
A doença de Alzheimer é a principal causa de demência na população idosa, afectando cerca de 10% das pessoas com mais de 65 anos, constituindo um problema grave de saúde pública. Os doentes com doença de Alzheimer sofrem um gradual declínio cognitivo e decréscimo das suas capacidades funcionais, progredindo para alterações psiquiátricas e comportamentais, eventualmente para um estado vegetativo e finalmente à morte. Em 1907, o Dr. Alois Alzheimer publicou um artigo onde, pela primeira vez, estabelecia uma ligação entre as características clínicas da doença de Alzheimer e as alterações neuropatológicas, os novelos neurofibrilhares e as placas neuríticas. Os novelos neurofibrilares são constituídos principalmente por proteína tau hiperfosforilada. As placas neuríticas são principalmente formadas pelo péptido β-amilóide (Aβ) e encontram-se normalmente envolvidas por neurites distróficas, microglia, e astrócitos activados. As placas neuríticas são o marcador por excelência da doença de Alzheimer, mas não se correlacionam directamente com o declínio cognitivo. Considera-se, portanto, que as placas neuríticas não são responsáveis pelo início do declínio cognitivo na doença de Alzheimer. Por outro lado, a acumulação progressiva de Aβ na sua forma solúvel em áreas vulneráveis do cérebro correlaciona-se bastante bem com o declínio cognitivo dos pacientes com doença de Alzheimer. Por isso, a diminuição dos níveis de Aβ é neste momento o principal objectivo das terapêuticas experimentais na doença de Alzheimer. A purificação do Aβ a partir de cérebro de doentes com doença de Alzheimer e a sua sequenciação conduziu à clonagem do gene da proteína precursora de amilóide (APP) e desencadeou a investigação sobre os mecanismos pelos quais o Aβ está envolvido na patogénese da doença de Alzheimer. O Aβ é gerado por duas clivagens do APP pela β- e γ-secretase sequencialmente, dando origem a duas formas de Aβ, uma mais longa de 42 aminoácidos, o Aβ42, e uma mais curta de 40 aminoácidos, o Aβ40. O Aβ42 é a forma mais hidrofóbica, mais xx propensa a agregar-se e associar-se a membranas intracelulares, e assim mais provável de acumular intracelularmente. O Aβ40 é mais solúvel sendo principalmente secretado. Em 1993, foi identificada pela primeira vez a presença de níveis apreciáveis de Aβ42 intracelularmente in vitro. Alguns anos mais tarde, com o desenvolvimento de anticorpos capazes de distinguir o péptido Aβ42 da proteína percursora, foi possível detectar também in vivo a acumulação intraneuronal de Aβ42 mesmo antes do aparecimento de placas. Desde então, vários estudos têm sugerido ser a acumulação intraneuronal de Aβ42 importante para a patogénese da doença de Alzheimer. A perda de sinapses é um dos eventos iniciais na doença de Alzheimer e é considerada a característica patológica que melhor se correlaciona com o declínio cognitivo. Várias linhas de investigação sugerem uma relação entre a acumulação de Aβ42 e a disfunção sináptica. A depressão da transmissão sináptica, incluindo redução da potenciação de longa duração (LTP), tem sido descrita em ratinhos transgénicos que constituem modelos de doença de Alzheimer, e ocorre concomitantemente com o aparecimento de Aβ42 intraneuronal, muito antes da presença das primeiras placas neuríticas. Esta observação sugere que a acumulação intracelular de Aβ42 pode ter um papel importante no desenvolvimento da doença de Alzheimer, especialmente nas fases iniciais da doença. Os ratinhos transgénicos Tg2576 possuem o transgene humano para o APP com a mutação Sueca da doença de Alzheimer familiar e desenvolvem β-amiloidose semelhante à doença de Alzheimer. Com o envelhecimento, o Aβ42 acumula-se e oligomeriza intracelularmente em neurónios de ratinhos Tg2576 in vivo, especialmente nas neurites, e compartimentos sinápticos. Para estudarmos a biologia celular da disfunção neuronal dependente de Aβ42, utilizámos culturas primárias de neurónios de ratinhos Tg2576, que reproduzem a acumulação progressiva de Aβ42 em cultura. Para melhor compreendermos as consequências da acumulação aberrante de Aβ42 começámos por caracterizar as sinapses destes neurónios. Neste estudo, encontrámos alterações estruturais e funcionais tanto pré- como pós-sinápticas em neurónios mutantes para o APP (Tg2576) aos 19 dias in vitro (DIV) quando comparados com neurónios de ratinhos não transgénicos (wild-type). As alterações pré-sinápticas incluíram a redução no número de terminais pré-sinápticos propensa a agregar-se e associar-se a membranas intracelulares, e assim mais provável de acumular intracelularmente. O Aβ40 é mais solúvel sendo principalmente secretado. Em 1993, foi identificada pela primeira vez a presença de níveis apreciáveis de Aβ42 intracelularmente in vitro. Alguns anos mais tarde, com o desenvolvimento de anticorpos capazes de distinguir o péptido Aβ42 da proteína percursora, foi possível detectar também in vivo a acumulação intraneuronal de Aβ42 mesmo antes do aparecimento de placas. Desde então, vários estudos têm sugerido ser a acumulação intraneuronal de Aβ42 importante para a patogénese da doença de Alzheimer. A perda de sinapses é um dos eventos iniciais na doença de Alzheimer e é considerada a característica patológica que melhor se correlaciona com o declínio cognitivo. Várias linhas de investigação sugerem uma relação entre a acumulação de Aβ42 e a disfunção sináptica. A depressão da transmissão sináptica, incluindo redução da potenciação de longa duração (LTP), tem sido descrita em ratinhos transgénicos que constituem modelos de doença de Alzheimer, e ocorre concomitantemente com o aparecimento de Aβ42 intraneuronal, muito antes da presença das primeiras placas neuríticas. Esta observação sugere que a acumulação intracelular de Aβ42 pode ter um papel importante no desenvolvimento da doença de Alzheimer, especialmente nas fases iniciais da doença. Os ratinhos transgénicos Tg2576 possuem o transgene humano para o APP com a mutação Sueca da doença de Alzheimer familiar e desenvolvem β-amiloidose semelhante à doença de Alzheimer. Com o envelhecimento, o Aβ42 acumula-se e oligomeriza intracelularmente em neurónios de ratinhos Tg2576 in vivo, especialmente nas neurites, e compartimentos sinápticos. Para estudarmos a biologia celular da disfunção neuronal dependente de Aβ42, utilizámos culturas primárias de neurónios de ratinhos Tg2576, que reproduzem a acumulação progressiva de Aβ42 em cultura. Para melhor compreendermos as consequências da acumulação aberrante de Aβ42 começámos por caracterizar as sinapses destes neurónios. Neste estudo, encontrámos alterações estruturais e funcionais tanto pré- como pós-sinápticas em neurónios mutantes para o APP (Tg2576) aos 19 dias in vitro (DIV) quando comparados com neurónios de ratinhos não transgénicos (wild-type). As alterações pré-sinápticas incluíram a redução no número de terminais pré-sinápticos activos e nos níveis de sinaptofisina, uma proteína de membrana das vesículas sinápticas. As alterações pós-sinápticas incluíram reduções nos níveis da subunidade GluR1 do receptor do glutamato do tipo AMPA e da proteína da densidade pós-sináptica, PSD-95. Uma vez que a acumulação de Aβ42 aumenta com o tempo em cultura, aos 19 DIV existe uma concentração mais elevada de Aβ42 com uma maior probabilidade de agregar e oligomerizar do que aos 12 DIV. Portanto, as alterações observadas aos 19 DIV podem corresponder a um fenótipo mais severo equivalente a um estádio avançado da doença. Assim sendo, na pesquisa das alterações iniciais, estudámos as sinapses de neurónios Tg2576 comparados com os neurónios wild-type aos 12 DIV. Présinapticamente, não encontrámos diferenças nem no número de terminais activos nem nos níveis de sinaptofisina, no entanto, pós-sinapticamente encontrámos uma redução no número e tamanho das espinhas dendríticas. Especificamente, as alterações pós-sinápticas incluíram a redução de PSD-95 e das subunidades dos receptores de glutamato AMPA ou NMDA (GluR1 ou NR1), na densidade pós-sináptica apesar de não haver diferença nos níveis totais celulares destas proteínas. Estes resultados sugerem que as primeiras alterações sinápticas surgem devido a uma alteração no tráfico de receptores de glutamato para as sinapses. Os receptores de glutamato são determinantes para a LTP e para a depressão de longa duração (LTD), fenómenos de plasticidade sináptica que estão associados aos processos de criação de novas memórias. Os nossos resultados elucidam as consequências da acumulação de Aβ nas sinapses, identificando as alterações iniciais que conduzem à disfunção sináptica e ao declínio cognitivo na DA. No entanto, apesar de termos identificado o Aβ como responsável pelas alterações sinápticas dos neurónios Tg2576, o mecanismo pelo qual a acumulação de Aβ afecta as sinapses necessita ser clarificado. Nos últimos anos, as evidências de que a acumulação intraneuronal de Aβ42 está envolvida na patogénese inicial da doença de Alzheimer têm aumentado. Apesar da controvérsia acerca de qual o organelo celular onde se origina o Aβ42 em neurónios, a localização preferencial da acumulação intracelular de Aβ42 na doença de Alzheimer é mais consensual. A acumulação de Aβ42 ocorre especialmente em endosomas multivesiculares (MVBs) no cérebro de ratinhos transgénicos para o APP e de humanos com doença de Alzheimer. Os endosomas têm sido descritos como anómalos na DA e estas alterações encontra-se entre as detectáveis na doença de Alzheimer. No entanto, os mecanismos moleculares responsáveis pelo aparecimento e participação destas alterações na patogénese da doença de Alzheimer permanecem desconhecidos. No cérebro, a acumulação de Aβ42 com o envelhecimento ocorre predominantemente na membrana exterior dos MVBs e junto a sinapses em degenerescência. Colocámos, por isso, a hipótese de que a acumulação de Aβ42 poderá afectar a via de sorting dos MVBs em neurónios. Os MVBs são organelos vesiculares morfologicamente caracterizados por uma membrana exterior e vesículas internas características. MVBs são considerados endosomas tardios, que se formam por maturação de endosomas primários por invaginações membranares que geram as vesículas internas. As vesículas internas têm uma composição lípidica e proteica particularmente rica em colesterol, LBPA (ácido lisobisfosfatídico) e glicoproteínas lisosomais, e um pH mais ácido. Os MVBs estão envolvidos em muitas funções celulares, que incluem o tráfico de várias proteínas e receptores membranares. O tráfico do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) para os MVBs tem sido extensivamente estudado. O EGFR, após activação pelo EGF, é internalizado para os endosomas primários. O complexo EGF-EGFR é estável ao pH dos endosomas primários e por isso segue a via dos MVBs. Durante a maturação endosomal, a formação dos MVBs através da invaginação da membrana exterior dos endosomas, retém os receptores no interior dos MVBs, prevenindo a sinalização dos receptores, e promovendo a sua subsequente degradação no meio mais ácido das vesículas internas e nos lisosomas. Nos neurónios, o papel funcional dos MVBs é pouco conhecido. Pensa-se que os MVBs têm um papel importante no transporte retrógrado, conduzindo receptores dos terminais nervosos para o corpo celular onde a sinalização ou degradação lisosomal ocorre. Por exemplo, os receptores de neurotrofinas são activados por ligação de factores de crescimento, internalizados pré-sinapticamente e transportados em MVBs para o corpo celular onde a sinalização para o núcleo ocorre, prevenindo-se assim a perda de sinal durante o transporte. O sorting dos receptores de neurotrofinas para os MVBs é particularmente importante para o receptor TrkB, que após ligação do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é rapidamente removido da superfície celular por endocitose e segue a via dos MVBs. Resolvemos estudar a via de sorting dos MVBs em neurónios primários Tg2576 para avaliar as consequências da acumulação de Aβ42 nos MVBs. Para estudarmos a via de sorting dos MVBs seguimos o tráfico do EGFR após activação por ligação de EGF, cujo tráfico endocítico está melhor caracterizado. Demonstrámos que o processo de internalização e reciclagem é normal nos neurónios Tg2576 mas o sorting do EGFR nos MVBs estava afectado. Observámos que havia acumulação de EGF-EGFR nos MVBs de neurónios Tg2576 quando comparados com neurónios wild-type, sugerindo que a degradação de EGFR está diminuída. Verificámos, ainda, que o sorting nos MVBs e a degradação de um outro complexo receptor-ligando, BDNF-TrkB, estavam também alterados de forma análoga. Para obtermos mais informação acerca do tráfico do EGFR nos MVBs, medimos os níveis de EGFR fosforilado (P-EGFR), uma vez que a desfosforilação do receptor ocorre após a translocação do EGFR para o interior dos MVBs, e encontrámos um aumento de P-EGFR nos neurónios Tg2576. Estes resultados sugerem que o tráfico do EGFR nos MVBs que acumulam Aβ42 se encontra alterado. A ubiquitinação do EGFR é necessária ao tráfico para os MVBs, para a translocação para o interior dos MVBs, e para a eventual degradação do EGFR. Uma diminuição da ubiquitinação do EGFR, com redução da translocação do EGFR para as vesículas interiores e subsequente degradação, seria uma justificação possível para a redução da degradação observada. No entanto, os níveis de ubiquitina conjugada ao EGFR encontravam-se aumentados nos neurónios Tg2576, sugerindo que a conjugação de ubiquitina não se encontra alterada. Assim sendo, uma outra hipótese para justificar a acumulação de EGFR ubiquitinado seria uma alteração na actividade de desubiquitinação nos neurónios Tg2576. Efectivamente, a análise da actividade de enzimas desubiquitinantes confirmou uma redução na desubiquitinação em neurónios Tg2576, no entanto a redução, sendo modesta, pareceu-nos insuficiente para a elevada ubiquitinação do EGFR. Nos últimos anos, o sistema da ubiquitina-proteasoma (UPS) tem sido implicado na regulação do tráfico do EGFR e da via dos MVBs. Por um lado, a actividade do proteasoma foi descrita como necessária à desubiquitinação do EGFR, sendo um passo necessário para a sua translocação para o interior dos MVBs, por outro lado, a inibição do proteasoma leva a uma redução da degradação do EGFR. Por isso, medimos a actividade do proteasoma em neurónios Tg2576 em comparação com neurónios wild-type. A actividade do proteasoma revelou-se bastante reduzida nos neurónios Tg2576, sendo esta inibição devida à acumulação de Aβ. Uma vez que a inibição do proteasoma também inibe a desubiquitinação, a inibição da actividade do proteasoma pode ser responsável pela alteração no tráfico de EGFR e também pelas restantes alterações celulares que descrevemos em neurónios Tg2576. Assim, a acumulação de Aβ42 é responsável pelas alterações da via dos MVBs e do UPS em neurónios Tg2576, uma vez que a inibição da acumulação de Aβ preveniu as alterações celulares nestes neurónios, incluindo a inibição do proteasoma. Para suportar a evidência de que o proteasoma está inibido pelo Aβ42 em neurónios mutantes para o APP, descrevemos ainda que a inibição do proteasoma em neurónios wild-type produz alterações na via dos MVBs que são equivalentes às que observámos em neurónios Tg2576. A descoberta de que o Aβ42, o péptido associado à doença de Alzheimer, que se localiza e acumula especialmente nos MVBs, altera o tráfico de receptores da membrana através da inibição do UPS, sugere um mecanismo pelo qual a acumulação de Aβ42 contribui para a patogénese da doença de Alzheimer. O UPS é um sistema complexo que participa em diferentes vias bioquímicas que se interceptam, e tem sido progressivamente considerado como tendo importantes funções celulares para além da degradação de proteínas. As funções celulares do UPS incluem a regulação da reciclagem e degradação de receptores membranares e a regulação da plasticidade sináptica. Concluímos que a inibição do tráfico endocítico de receptores neuronais pelo Aβ42 poderá ser a causa da disfunção sináptica na doença de Alzheimer. Os nossos resultados propõem um novo mecanismo pelo qual a acumulação de Aβ42 altera a biologia celular de neurónios vulneráveis na doença de Alzheimer.
Descrição: Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Neurociências Básicas), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2007
URI: http://hdl.handle.net/10451/6401
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