Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/6583
Título: Heavy metal resistance in extremophilic yeasts: a molecular and physiological approach
Autor: Fidalgo, Cátia Isabel Assis, 1986-
Orientador: Chaves, Sandra Isabel Mourinha Lopes, 1974-
Tenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade,1952-
Palavras-chave: Microbiologia
Leveduras
Metais pesados
Cryptococcus
Expressão génica
Biologia molecular
Teses de mestrado - 2011
Data de Defesa: 2011
Resumo: Heavy metal resistant microorganisms are often associated with acidic environments, since metals are easily solubilized in acidic milieus. A unique yeast species from the Cryptococcus genus was isolated from two sulfur-rich acidic environments: acid mine drainage in the south of Portugal and a volcanic river in Argentina. The uniqueness of this species lies on the fact that it is the first acidophilic basidiomycetous yeast known to date. Additionally, the two strains chosen for this work (one from each environment) are resistant to high levels of heavy metals (arsenic, cadmium, copper and zinc). Metal resistance mechanisms are only described for neutrophilic yeasts, and mainly involve thiolated peptides and efflux transporters. To unveil the mechanisms that allow this Cryptococcus species to resist high levels of heavy metals, physiological, cytological and molecular approaches were conducted. Since both isolation sites are sulfur-rich, the possibility that this element influences metal resistance was assessed with microscale growth assays by determining minimal inhibitory concentrations of the four metals in differential sulfate availability conditions. Assessment of thiolmediated resistance mechanisms was achieved by incubating cells (grown with and without metal) with the thiol-specific fluorescent probe 5-chloromethylfluorescein-diacetate. Dot blot hybridization was applied to detect gene homologues involved in arsenic extrusion, and vacuolar metal-thiol accumulation in response to arsenic and cadmium. Also, suppression subtractive hybridization was conducted to investigate resistance to cadmium by analyzing transcripts induced upon exposure to this metal. Our results indicate that thiolated peptides are involved in resistance to arsenic and zinc in the Portuguese strain, cadmium in the Argentinean strain, and copper in both strains. Also, both strains presented evidence of an arsenic extrusion mechanism, and of a Cd-induced demand in protein synthesis and folding. Thus, the present work allowed unveiling of heavy metal resistance mechanisms in two strains of this unique novel yeast species, Cryptococcus sp.
Existem diferentes critérios para definir ‘metal pesado’ que consideram diferentes características dos elementos metálicos. No entanto, o critério mais aceite consiste na comparação da gravidade específica do metal em relação à da água: metal pesado é aquele cuja gravidade específica é pelo menos cinco vezes superior à da água. Esta qualidade é atribuída a elementos essenciais como o cobre e o zinco, e a elementos não essenciais como o arsénio e o cádmio (Lide, 2009). Metais pesados, essenciais e não essenciais, podem ser tóxicos para todos os organismos, pelo que ao longo da evolução foram desenvolvidas diversas estratégias de destoxificação em resposta à presença destes elementos em excesso. Em microorganismos, este tipo de estratégias encontra-se principalmente caracterizado em organismos modelo com aplicações clínicas ou na indústria, como Escherichia coli, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe. No entanto, os níveis de resistência a metais pesados que estes microorganismos exibem é baixo em comparação com os níveis observados em microorganismos isolados de locais extremos, como por exemplo ambientes aquáticos ácidos ricos em metais pesados (Dopson et al., 2003). Em leveduras, as principais estratégias descritas em leveduras consistem em mecanismos que levam à destoxificação do citoplasma (Perego & Howell, 1997; Tsai et al., 2009). Estes podem ser exercidos por transporte dos metais para o exterior da célula, mediado por transportadores específicos, ou por acumulação dos metais, normalmente complexados com péptidos tiolados, em organitos como o vacúolo (revisto em Tamás & Wysocki, 2010). Microorganismos resistentes a metais pesados estão frequentemente associados a ambientes acídicos, visto que a solubilização destes metais é facilitada em meios com pH baixo. Um exemplo deste tipo de ambiente existe na Faixa Piritosa Ibérica cuja extensão inclui o Rio Tinto, em Espanha, e as minas de São Domigos, no sul de Portugal. Dada a exploração de minérios associada a estes locais, os depósitos estáveis de minerais associados a diferentes metais foram expostos ao ar e água, o que conduziu à lenta reacção espontânea de oxidação desses mesmos minerais (Johnson & Hallberg, 2003). Comunidades de microorganismos litotróficos, presentes nas águas associadas a estes locais, aceleraram o processo de oxidação de minerais, visto que permitiram a regeneração de compostos necessários à reacção de oxidação. Um destes compostos, o ião férrico, em conjunto com o pH baixo permitiu uma manutenção da oxidação e lixiviação de metais que, dada a sua solubilidade mais facilitada em águas ácidas, ficam mais concentrados (López-Archilla et al., 2001; Johnson & Hallberg, 2003). Este tipo de contaminação da água por oxidação de minerais expostos é denominado drenagem ácida de minas. A geologia local das minas de São Domingos é dominada por depósitos sulfúricos polimetálicos e inclui um lago particularmente extremo na Achada do Gamo, com o pH mais baixo de todos os lagos envolventes (pH 1.8) e com concentrações elevadas de enxofre e vários metais (Gadanho et al., 2006). Por outro lado, ambientes aquáticos extremos com pH baixo e elevada concentração de metais podem ter uma origem relacionada com actividade vulcânica, como é o caso do Rio Agrio, localizado na Patagónia Argentina (Pedrozo et al., 2001). Neste caso, a acidez da água do rio é uma consequência directa da produção de ácido sulfúrico no interior do vulcão, devido à actividade geotérmica e consequente emissão de gases do vulcão. Devido a interacções químicas, a acidez das águas leva a um desgaste da geologia vulcânica local e resulta em elevadas concentrações de enxofre e metais na água (Pedrozo et al., 2001; Russo et al., 2008). Na parte superior deste rio (mais próxima do vulcão), o pH é de 2.2 e foram observadas concentrações elevadas de enxofre e metais pesados como ferro, zinco e arsénio (Russo et al., 2008). Uma nova espécie pertencente ao género Cryptococcus foi isolada em dois locais extremos distintos: Achada do Gamo, nas minas abandonadas de São Domingos (Gadanho et al., 2006); e Rio Agrio, na Patagónia Argentina (Russo et al., 2008). Para realizar o presente trabalho foram escolhidas duas estirpes desta espécie – uma de cada local. As estirpes desta espécie requerem pH baixo para crescer eficientemente, o que torna Cryptococcus sp. a primeira levedura basidiomicete acidófila conhecida até à data (Russo et al., 2008). Adicionalmente, apresentam níveis de resistência a metais pesados mais elevadas que as toleradas por microorganismos modelo (Gadanho et al., 2006). No presente estudo foram pesquisados mecanismos pelos quais estas duas estirpes conseguem resistir a níveis elevados dos metais pesados arsénio, cádmio, cobre e zinco, tendo em consideração um eventual papel do enxofre nos mecanismos de resistência aos metais. Para tal, foram usadas abordagens experimentais a nível fisiológico, citológico e molecular. As metodologias aplicadas incluíram ensaios de crescimento em microescala para determinar concentrações mínimas inibitórias para cada metal em diferentes condições de disponibilidade de sulfato. Por análise das diferenças nos níveis de resistência a cada metal pesado em condições diferenciais de sulfato, foi possível compreender a influência que a disponibilidade de sulfato exerce sobre os níveis de resistência a cada metal pesado. Foi também avaliado o eventual papel da forma química do composto metálico adicionado ao meio de cultura (arsenato vs. arsenito no caso do arsénio, e sulfato de metal vs. cloreto de metal para os outros metais). A destoxificação de metais pesados por acumulação de péptidos tiolados está largamente descrita na literatura como sendo uma estratégia generalizada de resistência a metais pesados em leveduras. Por esta razão, a possibilidade da existência desta estratégia na espécie acidófila foi averiguada. Para tal, técnicas citológicas para observação em microscopia de fluorescência foram optimizadas e aplicadas nas duas estirpes, para os quatro metais pesados em estudo. As duas estirpes foram crescidas em meio com e sem metais pesados, e foram incubadas com uma sonda fluorescente específica para grupos tiolados, a diacetato-5-clorometilfluoresceína (CMFDA). A observação destas células em microscopia de fluorescência permitiu avaliar variações na intensidade de fluorescência provocadas pela presença dos metais. A observação de diferenças nas intensidades de fluorescência em condições diferenciais de crescimento (com metal vs. sem metal) foi interpretada como indicação de participação de péptidos tiolados nos mecanismos de destoxificação. Foram também optimizadas e aplicadas metodologias de biologia molecular para averiguar a presença de homólogos de genes envolvidos no efluxo de arsénio, e de homólogos de um gene envolvido na acumulação de arsénio e cádmio no vacúolo da célula. A metodologia aplicada para este fim foi hibridação de DNA por ‘dot blot’ que consiste na utilização de uma sonda, que corresponde ao gene que se pretende detectar, com o DNA genómico das estirpes em análise. Os genes pesquisados incluíram dois homólogos de genes envolvidos no transporte de arsénio para o exterior da célula (arsA e arsB), e um homólogo de um gene envolvido na acumulação vacuolar de arsénio e cádmio (ycf1). As sondas para esta hibridação foram obtidas por PCR a partir do DNA genómico da espécie-tipo do género Cryptococcus, C. neoformans. Para tal, foram desenhados primers ‘forward’ e ‘reverse’ para cada um dos três genes, e foram conduzidas reacções de PCR com um nucleótido marcado com digoxigenina (DIG-dUTPs). Os produtos de PCR obtidos foram então usados como sondas na procura de homologia dos genes indicados nas duas estirpes em estudo. Neste trabalho foi também incluída uma abordagem transcriptómica para análise e identificação de genes diferencialmente expressos em células crescidas na presença e na ausência de cádmio. Para tal, foi extraído RNA de células obtidas em condições diferenciais (com e sem cádmio) em fase exponencial de crescimento e o mRNA foi purificado a partir do RNA total. Posteriormente, foi realizado um processo de hibridação subtractiva supressiva nas duas estirpes, no qual se obteve uma biblioteca de cDNA correspondente a transcritos cuja expressão foi aumentada na presença de cádmio. Após sequenciação, estes transcritos foram identificados comparação com bases de dados de sequências presentes no ‘National Center for Biotechnology Information’ (NCBI). As metodologias aplicadas e consequente análise de resultados permitiram inferir sobre alguns aspectos das estratégias que as duas estirpes de Cryptococcus sp. analisadas utilizam na destoxificação de metais pesados. Nomeadamente, na estirpe Portuguesa predomina a evidência de que se trata de um mecanismo de resistência principalmente mediado por tióis, com possível subsequente acumulação no vacúolo da célula. Por outro lado, no caso da resistência ao arsénio na estirpe Argentina, o principal mecanismo de destoxificação parece ser mediado por efluxo do metal, possivelmente por um homólogo da bomba de efluxo ArsB, associada a uma ATPase homóloga de ArsA. Os resultados obtidos na resistência ao cádmio também indicam variabilidade intra-específica, uma vez que há indicação de um mecanismo de resistência mediado por tióis para a estirpe Argentina. No entanto, com base nos dados obtidos não foi possível sugerir um mecanismo específico para a estirpe Portuguesa. No caso da resistência ao cobre, os resultados sugerem a existência de um mecanismo mediado por tióis em ambas as estirpes, com a possibilidade de um mecanismo adicional que pode operar predominantemente na estirpe Portuguesa. Finalmente, a análise dos resultados obtidos sob exposição das leveduras a elevadas concentrações de zinco sugerem a possibilidade de acumulação deste metal em compartimentos celulares como o vacúolo. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram variabilidade intra-específica nos mecanismos de destoxificação de metais pesados em Cryptococcus sp., visto que nem sempre a mesma estratégia de resistência a metais pesados foi observada nas duas estirpes em estudo. Foi também verificada a possibilidade de existência de mais de um mecanismo de resistência a operar em simultâneo para apenas um metal, o que pode justificar a elevada resistência a metais pesados observada nas duas estirpes estudadas. Os mecanismos de destoxificação nesta levedura única deverão, então, ser alvo de análise em maior detalhe em investigação futura.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
URI: http://hdl.handle.net/10451/6583
Aparece nas colecções:FC - Dissertações de Mestrado

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato 
ulfc092954_tm_catia_fidalgo.pdf20,46 MBAdobe PDFVer/Abrir


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.