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Título: The role of the Delta-like 4 Notch ligand in tumor angiogenesis
Autor: Djokovic, Dusan, 1978-
Orientador: Duarte, António José de Freitas
Henrique, Domingos, 1960-
Palavras-chave: Neovascularização patológica
Neoplasias
Receptores notch
Preparações farmacêuticas
Quimioterapia
Teses de doutoramento - 2012
Issue Date: 2011
Resumo: Clinically significant tumors induce their own vascularization using molecular mechanisms involved in the regulation of physiological angiogenesis. One of these mechanisms is mediated by Delta-like 4 (Dll4)/Notch signaling, which is known to play a fundamental role in the regulation of embryonic angiogenesis and arterial specification. Up-regulated in animal and human tumors, Dll4 represents the focus of the work presented in this thesis, which aimed to characterize its function(s) in the regulation of tumor-driven angiogenesis and validate it as a potential therapeutic target. To achieve the proposed objectives, Dll4 loss- and gain-of-function phenotypes were characterized in grafted and autochthonous mouse tumor models. Additionally, pharmacological inhibition of Dll4/Notch signaling by soluble Dll4 extracellular domain (sDll4) was assessed as a therapeutic strategy, alone or in combination with the inhibition of downstream Ephrin-B2/EphB4 signaling by soluble extracellular EphB4 (sEphB4). Loss of Dll4 function by either targeted Dll4 allele deletion or use of sDll4 was shown to lead to increased, but defective and immature vascular proliferation in subcutaneously grafted malignancies (S180, HT29 and KS-SLK cell lines), as well as in autochthonous insulinomas of transgenic RIP1-Tag2 mice. The increase in endothelial activation was confirmed to reflect higher endothelial sensitivity to vascular endothelial growth factor A (VEGFA), while retarded vessel maturation, indicated by reduced mural cell recruitment, was found associated with EphrinB2 and Tie2 signaling suppression. This induction of unproductive angiogenesis resulted in significantly reduced tumor growth, creating a new perspective for tumor vasculature targeting. Regarding the suppression of vessel maturation and consequent tumor expansion, greater efficacy against RIP1-Tag2 insulinomas was observed when Ephrin-B2/EphB4 signalling inhibition by sEphB4 was combined with either Dll4 allele deletion or sDll4 treatment. Importantly, hepatic vascular alterations arising under chronic Dll4 inhibition were prevented by concomitant sEphB4 treatment. Apparently in contradiction to data obtained from advanced, aggressive and rapidly expanding tumors, my work demonstrated that Dll4 down-regulation in pre-malignant, DMBA/TPA-induced chemical skin papillomas, promotes productive, although less mature angiogenesis, as well as neoplasm growth. In both benign and malignant tumors, Dll4 was found to serve as a fundamental suppressor of excessive endothelial proliferation. The observed difference in skin papillomas might be due to the capacity of tumor neo-vessels to mature and gain functionality in early but not in invasive lesions. In these lesions, higher VEGFA levels and decreased VEGFA gradients result in disorganized endothelial proliferation that does not permit functional vessel formation if Dll4/Notch is even partially suppressed. These findings therefore imply that Dll4 requirement to normalize tumor vasculature increases with the tumor grade, being always critical to hold down VEGFA-induced angiogenesis. Nevertheless, my results reveal that Dll4 functions as a very delicate determinant of tumor success and progression, although vascular response quite expectedly changes with its alteration. By exploring the effects of increased endothelial Dll4 expression to the supra-basal levels in Lewis lung cancer xenografts, chemically-induced skin tumors and transgenic RIP1-Tag2 insulinomas, this work shows that Dll4 over-expression also decreases tumor growth due to significant suppression of angiogenesis and pronounced reduction of overall tumor blood supply. Although increased Dll4 function consistently improved tumor vascular maturation and functionality, the tumor vessel normalization did not predominate over the tumor-suppressive effects of restricted vessel proliferation, in the experimental settings used. Thereby, Dll4 over-expression appeared as an alternative that, beside the anti-angiogenic effects, might reduce malignant cell penetration into the bloodstream and ensure increased delivery and effectiveness of co-applied chemotherapy, due to improved vessel maturation and competence. Collectively, Dll4 plays a prominent role as negative regulator and pro-maturation factor in tumor-driven angiogenesis. Interference with Dll4/Notch may be desirable in cancer patients, while the choice of an agonistic or antagonistic approach will probably depend on tumor type and further toxicity and efficacy assessments, particularly when applied in combination with other anti-angiogenic and cytostatic drugs.Tumores clinicamente significativos induzem a sua própria vascularização. Para isso, frequentemente utilizam os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da angiogénese fisiológica. Uma destas vias é via de sinalização Delta-like 4 (Dll4)/Notch, que se sabe desempenhar um papel fundamental na regulação da angiogénese embrionária e na especificação arterial. Encontrando-se a sua expressão aumentada em tumores humanos e animais, Dll4 constituiu o principal foco deste projecto de Doutoramento, que teve como objectivo caracterizar a sua função na regulação da angiogénese tumoral e validar este ligando de receptores Notch como um potencial alvo terapêutico. Para atingir os objectivos propostos, fenótipos de perda- e de ganho-de-função de Dll4 foram caracterizados em modelos tumorais enxertados e autóctones em murganhos. Além disso, a inibição farmacológica da via Dll4/Notch com uma proteína solúvel contendo o domínio extracelular de Dll4 (sDll4) foi avaliada como uma estratégia mono-terapêutica, e, subsequentemente, em combinação com a inibição da via de sinalização Ephrin-B2/EphB4, que se sabe actuar a jusante da via Dll4/Notch, realizada com administração de uma proteína solúvel contendo o domínio extracelular de EphB4 (sEphB4). A perda da função de Dll4 por deleção monoalélica de Dll4 ou por administração de sDll4 resultou em proliferação vascular aumentada, mas defeituosa e imatura, em tumores enxertados subcutaneamente (linhas celulares S180, HT29 e KS-SLK), assim como em insulinomas autóctones de murganhos transgénicos RIP1-Tag2. O aumento da activação endotelial foi confirmado como resultante do aumento da sensibilidade endotelial ao factor de crescimento endotelial vascular A (VEGFA), enquanto a maturação vascular retardada, indicada pelo recrutamento diminuído das células murais, foi associada com a supressão da sinalização de EphrinB2 e da função de Tie2. Esta indução da angiogénese não produtiva resultou em redução significativa do crescimento tumoral, representando a base racional de uma nova, e potencialmente benéfica, estratégia para interferir com a neo-vascularização em tumores. Em relação à supressão da maturação vascular e à consequente expansão tumoral, observou-se uma maior eficácia na regulação do crescimento de insulinomas em murganhos RIP1-Tag2, quando a administração de sEphB4 foi combinada com a deleção monoalélica em Dll4 ou com o tratamento com sDll4. Adicionalmente, as alterações vasculares hepáticas decorrentes da inibição crónica de Dll4 foram impedidas pelo tratamento concomitante com sEphB4. Aparentemente em contradição com os dados obtidos a partir de tumores avançados, agressivos e em rápida expansão, a deleção de um alelo Dll4 em papilomas cutâneos pré-malignos, quimicamente induzidos com DMBA/TPA, resultou na promoção de produtiva, embora menos madura, bem como no maior crescimento destas neoplasias. Quer em tumores benignos como malignos, encontra-se documentada a função de Dll4 como importante supressor de proliferação endotelial excessiva. A diferença encontrada nestes estudos deve estar relacionada com a capacidade dos vasos tumorais ganharem funcionalidade no caso de lesões iniciais, mas não em lesões invasivas, onde os níveis mais elevados de VEGFA e diminuição dos gradientes de VEGFA resultam em proliferação endotelial tão desorganizada que praticamente não permitia a formação dos vasos funcionais se a sinalização Dll4/Notch estivesse suprimida, mesmo que parcialmente. Assim, os resultados aqui apresentados sugerem que a importância de Dll4 para normalizar a vascularização tumoral aumenta com o grau de malignidade, sendo sempre crítica para moderar a angiogénese induzida por VEGFA. No entanto, a função de Dll4 é um determinante critíco da progressão tumoral, embora a resposta vascular mude de um modo bastante previsível com as alterações na expressão de Dll4. Através da análise dos efeitos devidos ao aumento da expressão endotelial de Dll4 em enxertos de cancro pulmonar de Lewis, em tumores cutâneos quimicamente induzida e em insulinomas dos murganhos transgénicos RIP1-Tag2, é mostrado neste trabalho que Dll4 retarda também o crescimento tumoral devido à supressão significativa de angiogénese e redução acentuada da perfusão sanguínea do tecido neoplásico. Embora a presença aumentada de Dll4 tenha consistentemente melhorado a maturação e funcionalidade vascular nos modelos experimentais utilizados, a normalização dos vasos não predominou sobre os efeitos anti-tumorais decorrentes da restrição da proliferação vascular. Assim, a sobre-expressão de Dll4 surge como uma alternativa que, além dos efeitos anti-angiogénicos, pode reduzir a penetração de células malignas na corrente sanguínea e garantir uma maior eficácia da quimioterapia co-aplicada devido à promoção da maturação e competência vascular dos tumores. Em conclusão, Dll4 desempenha um papel de grande relevo na angiogénese induzida por tumores, quer como um regulador negativo de activação endotelial quer como factor de maturação vascular. Interferência com Dll4/Notch pode ser desejável em doentes oncológicos, embora a escolha de uma estratégia agonista ou antagonista dependerá provavelmente do tipo tumoral e do resultado da avaliação de segurança e eficácia que terá que ser feita, em particular quando aplicada em terapêutica de combinação com outros medicamentos anti-angiogénicos e citostáticos.
Tumores clinicamente significativos induzem a sua própria vascularização. Para isso, frequentemente utilizam os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da angiogénese fisiológica. Uma destas vias é via de sinalização Delta-like 4 (Dll4)/Notch, que se sabe desempenhar um papel fundamental na regulação da angiogénese embrionária e na especificação arterial. Encontrando-se a sua expressão aumentada em tumores humanos e animais, Dll4 constituiu o principal foco deste projecto de Doutoramento, que teve como objectivo caracterizar a sua função na regulação da angiogénese tumoral e validar este ligando de receptores Notch como um potencial alvo terapêutico. Para atingir os objectivos propostos, fenótipos de perda- e de ganho-de-função de Dll4 foram caracterizados em modelos tumorais enxertados e autóctones em murganhos. Além disso, a inibição farmacológica da via Dll4/Notch com uma proteína solúvel contendo o domínio extracelular de Dll4 (sDll4) foi avaliada como uma estratégia mono-terapêutica, e, subsequentemente, em combinação com a inibição da via de sinalização Ephrin-B2/EphB4, que se sabe actuar a jusante da via Dll4/Notch, realizada com administração de uma proteína solúvel contendo o domínio extracelular de EphB4 (sEphB4). A perda da função de Dll4 por deleção monoalélica de Dll4 ou por administração de sDll4 resultou em proliferação vascular aumentada, mas defeituosa e imatura, em tumores enxertados subcutaneamente (linhas celulares S180, HT29 e KS-SLK), assim como em insulinomas autóctones de murganhos transgénicos RIP1-Tag2. O aumento da activação endotelial foi confirmado como resultante do aumento da sensibilidade endotelial ao factor de crescimento endotelial vascular A (VEGFA), enquanto a maturação vascular retardada, indicada pelo recrutamento diminuído das células murais, foi associada com a supressão da sinalização de EphrinB2 e da função de Tie2. Esta indução da angiogénese não produtiva resultou em redução significativa do crescimento tumoral, representando a base racional de uma nova, e potencialmente benéfica, estratégia para interferir com a neo-vascularização em tumores. Em relação à supressão da maturação vascular e à consequente expansão tumoral, observou-se uma maior eficácia na regulação do crescimento de insulinomas em murganhos RIP1-Tag2, quando a administração de sEphB4 foi combinada com a deleção monoalélica em Dll4 ou com o tratamento com sDll4. Adicionalmente, as alterações vasculares hepáticas decorrentes da inibição crónica de Dll4 foram impedidas pelo tratamento concomitante com sEphB4. Aparentemente em contradição com os dados obtidos a partir de tumores avançados, agressivos e em rápida expansão, a deleção de um alelo Dll4 em papilomas cutâneos pré-malignos, quimicamente induzidos com DMBA/TPA, resultou na promoção de produtiva, embora menos madura, bem como no maior crescimento destas neoplasias. Quer em tumores benignos como malignos, encontra-se documentada a função de Dll4 como importante supressor de proliferação endotelial excessiva. A diferença encontrada nestes estudos deve estar relacionada com a capacidade dos vasos tumorais ganharem funcionalidade no caso de lesões iniciais, mas não em lesões invasivas, onde os níveis mais elevados de VEGFA e diminuição dos gradientes de VEGFA resultam em proliferação endotelial tão desorganizada que praticamente não permitia a formação dos vasos funcionais se a sinalização Dll4/Notch estivesse suprimida, mesmo que parcialmente. Assim, os resultados aqui apresentados sugerem que a importância de Dll4 para normalizar a vascularização tumoral aumenta com o grau de malignidade, sendo sempre crítica para moderar a angiogénese induzida por VEGFA. No entanto, a função de Dll4 é um determinante critíco da progressão tumoral, embora a resposta vascular mude de um modo bastante previsível com as alterações na expressão de Dll4. Através da análise dos efeitos devidos ao aumento da expressão endotelial de Dll4 em enxertos de cancro pulmonar de Lewis, em tumores cutâneos quimicamente induzida e em insulinomas dos murganhos transgénicos RIP1-Tag2, é mostrado neste trabalho que Dll4 retarda também o crescimento tumoral devido à supressão significativa de angiogénese e redução acentuada da perfusão sanguínea do tecido neoplásico. Embora a presença aumentada de Dll4 tenha consistentemente melhorado a maturação e funcionalidade vascular nos modelos experimentais utilizados, a normalização dos vasos não predominou sobre os efeitos anti-tumorais decorrentes da restrição da proliferação vascular. Assim, a sobre-expressão de Dll4 surge como uma alternativa que, além dos efeitos anti-angiogénicos, pode reduzir a penetração de células malignas na corrente sanguínea e garantir uma maior eficácia da quimioterapia co-aplicada devido à promoção da maturação e competência vascular dos tumores. Em conclusão, Dll4 desempenha um papel de grande relevo na angiogénese induzida por tumores, quer como um regulador negativo de activação endotelial quer como factor de maturação vascular. Interferência com Dll4/Notch pode ser desejável em doentes oncológicos, embora a escolha de uma estratégia agonista ou antagonista dependerá provavelmente do tipo tumoral e do resultado da avaliação de segurança e eficácia que terá que ser feita, em particular quando aplicada em terapêutica de combinação com outros medicamentos anti-angiogénicos e citostáticos.
Descrição: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Biopatológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/6646
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