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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/7134

Título: Modulation of fatty acid synthase and plasma membrane microdomains by hydrogen peroxide
Autor: Matias, Ana Isabel Ayres de Mendonça Cardoso,1980-
Orientador: Marinho,Helena Susana Pappámikail da Costa,1958-
Antunes,Fernando José Nunes,1969-
Palavras-chave: Membrana plasmática
Ácidos gordos
Issue Date: 2012
Resumo: Adaptation of Saccharomyces cerevisiae cells to hydrogen peroxide (H2O2) decreases plasma membrane permeability, slowing H2O2 diffusion into cells and turning cells more resistant to H2O2. The mechanism responsible for this change remains largely unknown. Here this mechanism was addressed revealing that fatty acid synthase (Fas) plays a key role during the cellular response of S. cerevisiae to H2O2: Adaptation to H2O2 was associated with a decrease in both Fas expression and activity. However, cellular effects of H2O2 were shown to vary over a narrow range of concentrations. Therefore, a tight control of H2O2 exposure is essential for cellular studies of H2O2-dependent redox regulation. The importance of Fas in adaptation was reinforced by the observation that the decrease of Fas activity by 50 % through deletion of one of the FAS1 alleles increases the resistance to lethal doses of H2O2. The plasma membrane of fas1 cells presented a large increase lignoceric acid (C24:0) (40%) and cerotic acid (C26:0) (50%) levels, suggesting that alterations in the plasma membrane composition of very-long-chain fatty acids (VLCFA) occur with Fas downregulation. Through interdigitation or by modulating formation of lipid rafts, VLCFA may decrease the overall or localized plasma membrane permeability to H2O2, respectively, thus conferring a higher resistance to H2O2. In agreement, fluorescence studies with transparinaric acid showed that both H2O2 adaptation and Fas downregulation increase the formation of lipid domains in the plasma membrane. Also, microscopy studies revealed that changes in Fas activity lead to the reorganization of plasma membrane domains. Preliminary studies in Jurkat T cells showed a decrease in plasma membrane fluidity, alteration to digitonin sensitivity and reorganization of membrane microdomains after exposure to a nonlethal H2O2 dose for 4 h. However, no relation between these changes and fatty acid synthase activity could be established. In conclusion, these results reveal the key role of Fas in the modulation of plasma membrane permeability to H2O2 during adaptation in S. cerevisiae and suggest that downregulation of FAS1 is the molecular mechanism by which H2O2 leads to the reorganization of the plasma membrane by remodelling specific membrane microdomains.
O peróxido de hidrogénio (H2O2) é a espécie reactiva de oxigénio mais abundante em organismos aeróbios, uma vez que é produzido intracelularmente de forma contínua. As suas características fisico-químicas, juntamente com a facilidade de difusão através das membranas celulares fazem com que o H2O2 seja uma importante molécula sinalizadora em diversos processos celulares. Porém, a regulação precisa dos níveis intracelulares de H2O2 é crucial, uma vez que a exposição a diferentes doses de H2O2 pode levar a respostas tão diferentes como proliferação celular, senescência, adaptação, apoptose ou necrose. Em Saccharomyces cerevisiae, a exposição a doses baixas de H2O2 (150 μM) leva à adaptação das células, tornando-as mais resistentes a uma exposição posterior a uma dose letal deste mesmo agente. Esta adaptação ao H2O2 deve-se não só a um aumento da actividade dos principais enzimas que catalisam a redução do H2O2 (catalase e citocromo c peroxidase), mas também a uma diminuição da permeabilidade da membrana plasmática ao H2O2, impedindo a sua difusão para o interior das células. O mecanismo reponsável por estas alterações permanece ainda desconhecido porém, estudos anteriores mostraram que a adaptação ao H2O2 leva a alterações na composição lipídica e organização da membrana plasmática, sendo este muito provavelmente responsável pelas alterações de fluidez e permeabilidade ao H2O2 detectadas. Estudos anteriores mostraram que, após uma curta exposição a uma dose adaptativa de H2O2, há um aumento dos níveis de esqualeno (intermediário na via de síntese do ergosterol), uma alteração na composição relativa dos principais fosfolípidos e uma reorganização dos microdomínios rígidos da membrana plasmática, enriquecidos em ergosterol e esfingolípidos. Neste estudo observaram-se também alterações nos níveis de expressão de genes envolvidos no metabolismo de lípidos, nomeadamente, de genes envolvidos na via biosintetica do ergosterol (ERG1, ERG3, ERG7 and ERG25) e do metabolismo de ácidos gordos (os genes ELO1, ELO2 and ELO3, envolvidos na enlongação de ácidos gordos, o gene OLE1 envolvido na desaturação de ácidos gordos e nos genes FAS1 e FAS2 codificantes para as duas sub-unidades do sintase de ácidos gordos). Uma vez que os ácidos gordos são um dos principais componentes das membranas, o sintase de ácidos gordos surgiu como um candidato interessante para o estudo das alterações celulares na adaptação ao H2O2. Neste trabalho fez-se então uma abordagem ao mecanismo de adaptação centrada nas alterações observadas no sintase de ácidos gordos (Fas), pretendendo-se compreender de que modo o H2O2 altera a actividade de Fas e de que modo as alterações na actividade xiv deste enzima alteram, por si, a resistência celular ao H2O2 e a composição e organização da membrana plasmática. Um dos principais resultados obtidos foi o de que a exposição de células de Saccharomyces cerevisiae a doses adaptativas de H2O2, que leva a uma diminuição da expressão do gene FAS1, levando consequentemente a uma diminuição da actividade de Fas. Porém, foi observada uma variação dos efeitos celulares do H2O2 num intervalo curto de concentrações de H2O2. Este resultado demonstra que é essencial que haja um controlo estrito da concentração de H2O2 a que as células estão expostas de modo a ter uma reprodutibilidade de resultados. A exposição em estado estacionário demonstrou ser a mais adequeada a este tipo de estudos, uma vez que permite a exposição prolongada a uma dose constante de H2O2, aproximando-se mais das condições fisiológicas. A sobre-expressão de FAS1 (conseguida através da construção de uma estirpe contendo o gene sob influência de um promotor regulável) levou por si a uma diminuição da capacidade de sobreviver a doses letais de H2O2, sendo esta reestabelecida com a diminuição da expressão de FAS1. A importância do gene FAS1 no mecanismo de adaptação ao H2O2 foi reforçada pela observação de que uma estirpe fas1 , com uma diminuição em aproximadamente 50 % dos níveis de expressão do gene FAS1 e consequente diminuição da actividade de Fas, apresenta por si uma maior resistência a doses letais de H2O2. Os níveis de actividade dos principais enzimas responsáveis pela remoção de H2O2 intracelular (catalase e citocromo c peroxidase) não aumentaram com a diminuição da expressão de FAS1 em 50 %. Os níveis de citocromo c peroxidase mostraram até ser inferiores na estirpe fas1 , o que demonstra que a maior resistência celular ao H2O2 nestas células não se deve a um aumento da capacidade de eliminação de H2O2. Estudos de integridade da parede celular (estrutura que poderia também actuar como barreira de entrada ao H2O2) mostraram não existirem alterações a nível da parede que possam justificar a diferente resistência ao H2O2. Deste modo a membrana plasmática, que já demonstrou no mecanismo de adaptação ao H2O2 ser uma estrutura dinâmica que sofre alterações de modo a limitar a difusão de H2O2 para o interior da célula, foi considerada como a principal responsável pela resistência acrescida ao H2O2 nas células fas1 . Efectivamente, a membrana plasmática da estirpe fas1 apresentou um aumento da razão PC/PE. Devido às suas características biofísicas, esta alteração leva por si a um aumento da rigidez da membrana plasmática. A membrana plasmática da estirpe fas1 apresentou também um aumento acentuado dos níveis de ácido lignocérico (C24:0) (40 %) e ácido cerótico (C26:0) (50 %), sugerindo que as alterações na composição da membrana plasmática em ácidos gordos de cadeia muito longa (VLCFA) estão envolvidas neste xv processo. Em concordância estão os estudos de fluorescência com ácido trans-parinárico que revelaram que a repressão de Fas leva a um aumento quantitativo e aumento da rigidez dos domínios gel da membrana plasmática. Também os estudos de microscopia com marcação dos princípais microdomínios da membrana plasmática de S. cerevisiae (MCCmicrodomains occupied by Can1 e MCP – microdomains occupied by Pma1) mostraram que as alterações na actividade de Fas levam a uma reorganização destes domínios lipídicos na membrana plasmática. A diminuição da actividade de Fas não provoca alterações significativas na distribuição dos domínios MCP (ao contrário do acontece na adaptação), observando-se, porém, um pequeno aumento dos níveis de Pma1p na membrana plasmática, embora não tão significativo como o observado no processo de adaptação ao H2O2. As maiores alterações foram observadas ao nível dos domínios MCC, que sofreram não só uma reorganização na membrana como um aumento em número na membrana plasmática das células da estirpe fas1 . As alterações nos MCC poderão estar associadas às restantes alterações observadas na membrana plasmática das células fas1 , uma vez que estes domínios se encontram normalmente associados aos eisossomas, estruturas organizadoras da membrana plasmática. Foram também efectuados alguns estudos preliminares em Jurkat mostraram que a exposição a uma dose não letal de H2O2 por tempos curtos leva a uma diminuição da fluidez da membrana plasmática acompanhada por uma alteração da sensibilidade à digitonina e por uma reorganização dos microdomínios da membrana plasmática. Não foi porém ainda possível estabelecer uma ligação entre estas alterações e a sintase de ácidos gordos. Em conclusão, este trabalho revela o papel fundamental de Fas na modulação da permeabilidade da membrana plasmática ao H2O2 durante o processo de adaptação e sugere que a repressão de Fas é um dos mecanismos moleculares pelos quais o H2O2 estimula a formação de jangadas lipídicas em S. cerevisiae. O proteína Fas é aqui apresentada pela primeira vez como um novo candidato na resposta ao stress oxidativo em S. cerevisiae.
URI: http://hdl.handle.net/10451/7134
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