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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10451/7181

Title: Correction of the ion transport defect in Cystic Fibrosis by small molecules
Authors: Sousa, Marisa Isabel Lopes de, 1983-
Advisor: Amaral, Margarida, 1958-
Kunzelmann, Karl, 1958-
Keywords: Fibrose quística
Marcadores biológicos
Genética - Mutações
Teses de doutoramento - 2012
Issue Date: 2012
Abstract: Cystic fibrosis (CF) is the most common life-shortening genetic disorder amoung Caucasians, affecting about 1 in 2500-6000 live births and with a carrier frequency of 1 in 25 individuals. More than 1900 CF mutations have already been reported on the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene, but one single mutation, named F508del, is responsible for 70% of CF chromosomes worldwide. CFTR is expressed at the apical membrane of epithelial cells to control salt and water transport. Clinically, CF is characterized by multiple manifestations in different organs, but is dominated by the respiratory disease, the main cause of morbidity and mortality. Bacterial infections, especially by Pseudomonas aeruginosa, cause inefficient mucociliary clearance, originating thick mucus, and recurrent infections give rise to an exacerbated inflammatory response contributing to impairment of respiratory function and ultimately to death. Other CF classical symptoms include exocrine pancreatic insufficiency (85%), intestinal obstruction (meconium ileus in 15-20% of CF newborns and/or distal intestinal obstruction syndrome at a later age), elevated sweat electrolytes and male infertility (95%). Besides this classic picture of the CF disease, there is a minority of patients presenting non-classic phenotypes and being diagnosed from child to adulthood. Moreover the increasing numbers of asymptomatic patients identified in recent newborn CF screens have posed major challenges to clinicians for the establishment of CF diagnoses, prognosis and adequacy of therapeutics. High-throughput screens have identified several novel small molecules with potential to treat the basic defect in CF and some are starting hit the clinical setting. These include correctors (like VX-661 and VX-809-Lumacaftor, both in Phase IIb clinical trial) that partially rescue the trafficking defect of F508del-CFTR, and a potentiator (like VX-770-, Ivacaftor (FDA-approved drug) that corrects the gating defect of G551D-CFTR, which underwent pre-clinical validation in CF airway primary cultures. However, to accelerate the entry of novel compounds into the clinic, the respective mechanism of action should be established, which usually requires studies in cellular systems with heterologous expression. Comparative efficacy assessment between heterologous expression systems and airway primary cutures/native human tissues is thus of the ultimate importance before CFTR modulators reach the clinical setting. In the first part of this work, we aimed to further establish measurement of CFTR function as a sensitive and robust biomarker for diagnosis and prognosis of CF. To this end, we assessed cholinergic and cAMP-CFTR-mediated Cl- secretion in 524 freshly excised rectal biopsies from 118 individuals, including patients with confirmed CF clinical diagnosis (n=51), individuals with clinical CF suspicion (n=49) and age-matched non-CF controls (n=18). Conclusive measurements were obtained for 96% of cases. Patients with "Classic CF", presenting earlier onset of symptoms, pancreatic insufficiency, severe lung disease and were found to lack CFTR-mediated Clsecretion (≤5%). Individuals with milder CF disease presented residual CFTRmediated Cl- secretion (10-57%), and non-CF controls show CFTR-mediated Clsecretion above 30-35%. Moreover, this data was well correlated with various clinical parameters and proved to be the best discriminator among Classic/Non-Classic CF and non-CF groups. Determination of CFTR-mediated Cl- secretion in rectal biopsies is demonstrated here to be a sensitive, reproducible and robust predictive biomarker for the diagnosis and prognosis of CF. In the second part, our goals were: first, to evaluate technical aspects of this procedure regarding the viability of the rectal specimens for ex vivo bioelectrical and biochemical laboratory analyses; and secondly, to evaluate the overall assessment (comfort, invasiveness, pain, sedation requirement, etc) of the rectal biopsy procedure from the patients perspective, in order to assess its feasibility as an outcome measure for (pre-)clinical trials. Regarding the technical aspects of biopsing, we compared three solutions for bowel preparation (NaCl 0.9%, glycerol 12% and oral mannitol), and two biopsy forceps (standard and jumbo) in 580 rectal specimens. As to the assessment of the overall rectal biopsy procedure, telephone surveys were applied to 75 individuals. Our data shows that disruption and friability of the specimens obtained correlate with their transepithelial resistance and are also influenced by the solution used for bowel preparation and biopsy forceps, with NaCl 0.9% proving to be the most compatible with the analysis and jumbo the best forceps. The great majority of the individuals (76%) did not report high levels of discomfort due to the short time (max 15 min) and relatively painless procedure (79%). Moreover, this procedure was shown to be well tolerated by patients with or without sedation: most (53%) accept repeating it four more times, demonstrating the feasibility of the current approach as an outcome measure for (pre-)clinical trials. Finally, in the last chapter of this thesis we proposed to evaluate the impact of different small molecules correctors and potentiators on CFTRprotein maturation and Cl- channel activity in heterologous cellular systems, so as to better understand their mechanism of action; and also to comparatively determine efficacy of those compounds in modulating CFTR activity in those systems and directly in primary cultures of human airway cells/and in native human tissues ex vivo. Functional data for F508del-CFTR rescue by iodide efflux on heterologous systems (BHK cells) shows that VRT- 325, C4a, VRT-640 and VRT-532 are all able to rescue CFTR function to at varying levels (26, 33, 19 and 35%, respectively of wt-CFTR function), with both VRT-325 and C4a having additive effects to the low temperature. On polarized F508del-transduced CFBE cells, VRT-325 and C4a treatment resulted 3.32 and 8.5% in CFTR function, respectively, relative to wt-CFTR monolayer cells. In contrast, preliminary data resulting from the functional analysis conducted in primary airway cells indicates that the efficiency of the correctors VRT-325 and C4a is reduced (4.18% and 3.16% of wt-CFTR function, respectively). Remarkably, VX-809 treatment resulted in a ~5.7-fold increase in CFTR-mediated Cl- secretion, which represents a recovery of ~16% of the CFTR function observed in primary non-CF HBE monolayers cells. Preliminary results in biopsies from F508del/F508del and F508del/G542X patients did not provide evidence for a clear effect for VRT-325 and nor C4a correctors, but showed a modest effect for a novel corrector compound (TS-01- 02-D8) which we recently identified. All together, these results suggest that the effects of a given compound in rescuing F508del-CFTR activity in heterologous systems are poorly predictive of its rescuing capacity in native tissues, which indicates that further pre-clinical validation in native tissues ex vivo is highly recommended.
A Fibrose Quística (FQ) e a doença autossómica recessiva letal mais comum na população Caucasiana, afectando cerca de 1 em 2500-6000 nados vivos, dependendo da região geográfica, e com uma frequência de portadores de 1 em cada 25 indivíduos. Esta doença e causada por mutações no gene CFTR (do inglês Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) localizado no cromossoma 7. Até à data, foram já descritas mais de 1900 mutações neste gene. No entanto, uma única mutação denominada por F508del (representando a deleção do aminoácido fenilalanina na posição 508 da proteína) é responsável por 70% dos cromossomas FQ mundiais. A proteína CFTR e expressa na membrana apical das células epiteliais onde funciona como um canal de cloreto (Cl-), regulando o transporte de sais e de água. Clinicamente, a FQ é caracterizada por múltiplas manifestações em diferentes órgãos, sendo contudo a doença a nível pulmonar a principal causa de morbilidade e mortalidade. A desidratação das vias respiratórias e a produção de secreções brônquicas extremamente viscosas devido a infecções bacterianas de repetição e persistentes, levam a um transporte/limpeza mucociliar ineficiente o que resulta na obstrução das glândulas exócrinas e, consequentemente, das vias respiratórias. Estas infecçoes bacterianas contribuem ainda para uma resposta inflamatória exacerbada que, por sua vez, origina o agravamento da insuficiência respiratória e, finalmente, a morte. Outros sintomas clássicos da FQ incluem insuficiência pancreática exócrina (85%), obstrução intestinal (íleo meconial em 15-20% dos recém-nascidos e/ou síndrome de obstrução intestinal distal na idade adulta), infertilidade masculina (95%) e concentração elevada de electrólitos no suor (característica utilizada no principal teste de diagnóstico). A apresentação dum quadro clínico grave, em conjunto com a demonstração de que a proteína CFTR e disfuncional, no geral, através de dois testes do suor alterados ou da detecção de duas mutações no gene CFTR, permitem o diagnóstico da maioria dos doentes ainda na primeira infância. No entanto, nem todos os doentes apresentam este quadro clássico da doenca, existindo um grupo de doentes que apresenta fenótipos não-clássicos, resultando no seu diagnóstico tardio, o que pode prejudicar o seu tratamento. Mais recentemente, os números crescentes de doentes FQ assintomáticos, identificados através dos programas de rastreio neonatal, têm colocado grandes desafios clínicos no que toca ao estabelecimento do diagnóstico FQ definitivo, prognóstico e adequadas estratégias terapêuticas. E crucial implantar um método que permita discriminar estes dois grupos de doentes através do seu diagnóstico diferencial. A FQ apesar de todos os avanços clínicos e científicos é actualmente ainda uma doença letal, sendo a esperança média de vida acima dos 25 anos. Felizmente, nos últimos anos tem vindo a ser identificadas, em screens de alto rendimento, diversas pequenas moléculas com potencial terapêutico para corrigir o defeito básico na FQ estando já algumas aprovadas para uso clinico. Como exemplo, existem: i) os compostos “correctores” como o VX-661 e o VX- 809-Lumacaftor (ambos em ensaio clínicos de fase IIb) que visam corrigir os defeitos básicos de folding e tráfego da proteína mutada, F508del-CFTR; e b) os compostos “potencializadores” (como o VX-770-Ivacaftor (recentemente aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), nos Estados Unidos da América) que pretendem restaurar o defeito de gating do canal de Cl- mutado, G551D-CFTR. Para poderem entrar em ensaios clínicos, todos estes compostos sofreram uma pré-validação clínica em culturas primárias de células epiteliais brônquicas humanas. No entanto, para acelerar a entrada de novos compostos em ensaios clínicos, os respectivos mecanismos de acção destas moléculas deverão ser determinados, o que, regra geral, exige estudos em sistemas celulares de expressão heteróloga. Deste modo, estudos que pretendam comparar a avaliação da eficácia destes compostos em sistemas de expressão heteróloga e em culturas primárias ou em tecidos nativos humanos são da máxima importância. A primeira parte deste trabalho procura consolidar a medição da função do canal CFTR como um marcador biológico sensível e robusto para o diagnóstico e prognóstico da doença FQ. Para este fim, avaliaram-se as secreções de Cl- através da CFTR com estimulação colinérgica e mediada pelo AMP cíclico (cAMP) em 524 biópsias rectais de 118 individuos. Este estudo incluiu pacientes com diagnostico clinico de FQ (n = 51), indivíduos com suspeita clínica de FQ (n = 49) e indivíduos controlos não-FQ (n = 18). No decorrer do estudo, foram obtidos resultados bioeléctricos conclusivos para 96% dos casos. Nos doentes clinicamente caracterizados com a forma clássica da doença, ou seja, apresentando um início mais precoce dos sintomas clínicos, insuficiência pancreática e doença pulmonar grave, observou-se uma ausência de secreção de Cl- mediada pela CFTR ou apenas existência de níveis muito baixos (≤ 5%). Para os indivíduos que apresentavam uma doença mais suave (não-clássica) e um diagnóstico mais tardio, foi possível a detecção de uma secreção de Cl- residual mediada pela CFTR (10-57%) e, no que diz respeito aos indivíduos controlo nao-FQ, a secreção de Cl- mediada pela CFTR situou-se acima dos 30-35%. Mais ainda, estes dados bioeléctricos evidenciaram boas correlações com os diversos parâmetros clínicos estudados, demonstrando constituir o melhor discriminador entre as formas clássica e não clássica da doença e estes e os indivíduos não-FQ. Assim, podemos concluir que a determinação da secreção de Cl- mediada pela CFTR em biópsias rectais e um marcador biológico sensível, reprodutível e robusto, e ainda preditivo prognóstico da FQ. O foco da segunda parte deste trabalho doutoral foi, por um lado, avaliar os aspectos técnicos deste procedimento em relação a viabilidade das amostras rectais para a realização das análises laboratoriais bioeléctricas e bioquímicas ex vivo; e, por outro lado, avaliar globalmente o procedimento de sigmoidoscopia para recolha da biópsia rectal (conforto, grau de invasão, dor, requisito de sedação, etc) sob a perspectiva do paciente, com o objectivo último de estimar a sua viabilidade como forma para avaliar a eficácia terapêutica de novas pequenas moléculas em ensaios (pré-)clínicos. Quanto aos aspectos técnicos deste procedimento, foram comparadas três soluções para a preparação intestinal (cloreto de sódio 0,9%, glicerol 12% e manitol oral) e duas pinças de biópsia (padrão e jumbo) em 580 biópsias rectais. Os dados recolhidos mostram que a integridade e friabilidade dos tecidos obtidos esta correlacionada com a sua resistência transepitelial, ou seja, com a sua viabilidade, sendo que quanto maior a integridade e menor friabilidade da biópsia, maior a resistência observada. Estas características dos tecidos colhidos são influenciadas pela solução utilizada durante a preparação intestinal e pinça de biópsia, sendo a preparação com cloreto de sódio e a pinça jumbo as que permitem uma maior viabilidade do tecido, logo mais compatíveis com a análise bioeléctrica . Quanto a avaliação global do procedimento de colheita da biópsia rectal, foram feitas entrevistas telefónicas a 75 indivíduos que tinham sido submetidos ao procedimento de sigmoidoscopia e colheita de biópsia. A grande maioria dos indivíduos (76%) nao relatou níveis elevados de desconforto devido ao curto período de tempo requerido (máximo 15 minutos) e ao facto deste procedimento ser praticamente indolor (79%). Além disso, este exame mostra ser bem tolerado pelos pacientes com ou sem sedação visto que maioria dos entrevistados (53%) aceitam repeti-lo mais quatro vezes, demonstrando a viabilidade desta abordagem como uma ferramenta para medir em ensaios (pré-) clínicos, a eficácia de novas moléculas com potencial terapêutico para a FQ. Finalmente, no último capítulo desta tese, avaliou-se o impacto de diferentes pequenas moléculas correctoras e potencializadoras da maturação e função da proteína CFTR mutada em sistemas celulares de expressão heteróloga, de modo a compreender melhor seu mecanismo de acção. Os dados funcionais resultantes da técnica de efluxo de iodeto em células BHK (sistema de expressão heteróloga) que expressam estavelmente a proteína mutante, F508del-CFTR, mostram que os compostos VRT-325, C4a, VRT-640 e VRT-532 são capazes de resgatar a função CFTR em níveis diferentes: 26, 33, 19 e 35% da função observada em wt-CFTR, respectivamente. Verificou-se ainda que tanto o VRT-325 como o C4a tem efeitos aditivos ao tratamento com baixa temperatura. Fez-se também uma análise comparativa da eficácia de tais compostos na actividade moduladora da CFTR em sistemas heterológos, em culturas primárias de células brônquicas humanas e em tecidos nativos (biopsias rectais). Em celulas CFBE transduzidas com um vector viral que expressa o mutante F508del-CFTR e polarizadas, o tratamento com os compostos VRT-325 e C4a resultou na correcção de 3.32 e 8,5% da função observada em wt-CFTR, respectivamente. Em contraste, os dados preliminares resultantes da análise funcional em células primárias do epitélio brônquico indicam que a eficiência dos correctores VRT-325 e C4a é reduzida neste sistema (4.18% e 3.16% da função observada em wt-CFTR, respectivamente). Notavelmente, o tratamento com o corrector VX-809-Lumacaftor resultou num aumento de cerca de 6 vezes da secreção de Cl- mediada pela CFTR relativamente a células CFBE F508del-CFTR controlo, este valor representa uma recuperação de ~16% da função da proteína CFTR observada em células primárias brônquicas não-FQ. No que diz respeito às medições da secreção de Cl- mediada pela CFTR em biópsias rectais de pacientes F508del/F508del e F508del/G542X, os resultados preliminares desta pesquisa não evidenciam um efeito claro dos correctores VRT-325 e C4a, mas mostram um efeito modesto para um outro composto corrector (TS-01-02-D8), recentemente identificado noutros estudos realizados no nosso laboratório. Os resultados apresentados para os compostos aqui estudados sugerem que a análise da correcção da actividade da proteína mutante F508del-CFTR como canal de Clem em sistemas heterólogos se revela pouco preditiva da sua capacidade real de restaurar esta função em culturas primárias e em tecidos nativos. Indicando, assim que a validação pré-clínica dos moduladores do canal CFTR em tecidos nativos (ex vivo) é de extrema importância para a avaliação correta do seu potencial interesse terapêutico. No global, o trabalho realizado nesta tese doutoral permitiu validar técnica de análise funcional da proteína CFTR como canal de cloreto em biópsias rectais com meio de diagnóstico discriminante e correcto prognóstico da doença FQ. Esta técnica revela-se ainda de grande interesse para a validação pré-clínica de terapias com novas moléculas com potencial para corrigir ou potencializar a função da CFTR em doentes FQ. Em conjunto, estes resultados poderão no futuro permitir um diagnóstico correcto da FQ e antecipar a validação de novas formas eficazes de terapia, o que tem uma importância crucial para a escolha da terapêutica mais eficaz e, consequentemente, para a melhoria de vida dos doentes com FQ.
Description: Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/7181
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