Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/7426
Título: Studying single-molecule protein interactions and its biological and biomedical applications by AFM-based force spectroscopy
Autor: Carvalho, Filomena A., 1976-
Orientador: Santos, Nuno C., 1972-
Palavras-chave: Microscopia de força atómica
Espectroscopia de força
Fibrinogénio
Células sanguíneas
Dengue
Proteínas
Teses de doutoramento - 2012
Data de Defesa: 2012
Resumo: The use of the knowledge and technology generated by nanomedicine research is slowly gaining its way into the clinical areas. Nanomedicine can be defined as the application of nanotechnologies in medicine, to monitor, diagnose and cure diseases, by using molecular knowledge of the human organism to maintain and improve human health at the molecular scale. In this thesis, we proposed to use force spectroscopy based on atomic force microscopy, a nanotechnology approach, to understand the single-molecule mechanisms involved in two different biomedical relevant systems: (i) Fibrinogen interaction with human blood cell membranes (erythrocytes and platelets) receptors. Increased plasma fibrinogen levels are associated with increased erythrocyte aggregation in cardiovascular diseases. With our results, we identified a specific binding between fibrinogen and an erythrocyte integrin receptor with a β3 or β3-like subunit. This interaction decreases significantly upon erythrocyte aging. We presume that young erythrocytes are the main contributors to the cardiovascular diseases associated with increased fibrinogen content in blood. (ii) Dengue virus (DENV) capsid (C) protein interaction with lipid droplets or lipoproteins. Lipid droplets (LDs) and/or lipoproteins may play an important role on Dengue virus pathogenesis. Our results could explain the key processes occurring in vivo on the Dengue virus replication. We found that DENV C N-terminal region is crucial for the interaction with LDs and very low density lipoproteins (VLDL), requiring the presence of potassium and intrinsic protein(s). Also, pep14-23, a peptide based on the DENV C N-terminal conserved region, inhibits the DENV C-LDs interaction. These findings may be important for the development of C protein-targeted treatments for DENV infections. The main findings described on both of these studies contribute to the establishment of atomic force microscopy as a biomedical tool used to improve knowledge on the molecular mechanisms associated with the development of diseases and their effective treatment.
Durante as últimas décadas, a Nanomedicina tem vindo a se tornar numa área científica emergente e em elevada expansão. O termo “Nanomedicina” é definido como a aplicação de técnicas nanotecnológicas em medicina, através do conhecimento, ao nível molecular, do organismo humano para manutenção e melhoria da saúde humana. Através da nanotecnologia é possível criar e desenvolver equipamentos que permitam a análise de sistemas in vivo ao nível molecular. Nos últimos anos, o grau de aceitação ao nível clínico do uso destas nanotecnologias tem vindo a aumentar, contudo, ainda há muito a desenvolver na área da aplicação da Nanomedicina na monitorização, diagnóstico e possível cura de doenças. Atualmente, as grandes empresas farmacêuticas estão mais recetivas à aplicação destas novas tecnologias, mas há sempre a considerar a relação custo/beneficio, bem como os eventuais riscos associados à sua aplicação. Neste trabalho foi utilizada, maioritariamente, a técnica de espectroscopia de força através de um microscópio de força atómica, para identificar interações específicas entre moléculas, conhecer possíveis mecanismos de desencadeamento da doença e apontar possíveis alvos de terapêutica e diagnóstico de duas patologias distintas, doença cardiovascular e infeção pelo vírus da Dengue. Estas duas diferentes aplicações do microscópio de força atómica são exemplos de como é possível a utilização deste equipamento como método de diagnóstico e caracterização funcional aplicado à área da Nanomedicina: Parte I: Estudo da interação do fibrinogénio com um recetor de membrana eritrocitário, na saúde e na doença. O aumento dos níveis de fibrinogénio conduz a alterações das propriedades reológicas do sangue, tais como o aumento da viscosidade plasmática, da agregação eritrocitária e da trombogénese, juntamente com alterações da reatividade vascular e da integridade endotelial. Essas alterações intensificam as complicações na circulação sanguínea periférica em patologias cardiovasculares. A agregação eritrocitária tem adquirido um elevado interesse na avaliação do risco de eventos cardiovasculares primários ou secundários, uma vez que é principalmente influenciada pelo aumento dos níveis plasmáticos de fibrinogénio e de lípidos. É nestas condições clínicas e na fase não aguda da doença que se torna mais premente a determinação da agregação eritrocitária como indicador do risco cardiovascular associado. Um estudo detalhado das interações entre eritrócitos e moléculas de fibrinogénio, de modo a compreender as consequências do seu aumento em patologias cardiovasculares, revelou-se assim necessário. O nosso primeiro trabalho demonstrou a ligação entre moléculas de fibrinogénio e um recetor anteriormente desconhecido na membrana eritrocitária, com afinidade comparável mas menor tempo de vida que a ligação fibrinogénio-plaqueta. A interação fibrinogénio-plaqueta, essencial na coagulação, depende de um recetor da membrana plaquetária, a glicoproteína αIIbβ3 (GP αIIbβ3). O recetor eritrocitário que identificámos não é tão fortemente influenciado pela presença de cálcio nem de eptifibatide, um inibidor específico da GP αIIbβ3, mas a sua inibição na presença de eptifibatide indica que o recetor é semelhante à integrina αIIbβ3. Os resultados obtidos com sangue de doentes com trombastenia de Glanzmann (GT, uma doença hemorrágica hereditária rara causada por deficiência na GP αIIbβ3) mostraram uma deficiência também na interação fibrinogénio-eritrócito. A correlação com os dados genéticos demonstrou que uma das unidades do recetor do fibrinogénio nos eritrócitos é um produto da expressão do gene da β3. O estudo seguinte, efetuado com o intuito de relacionar a interação fibrinogénioeritrócito com o processo de senescência celular, indicou que o recetor para o fibrinogénio na membrana no eritrócito pode desaparecer, ficar “mascarado” ou tornar-se disfuncional com o processo in vivo de senescência celular. Os resíduos de ácido siálico parecem também ter uma função importante como promotores da interação fibrinogénio-eritrócito. A diminuição desta interação durante o processo de senescência poderá estar largamente associada à progressiva depleção de ácidos siálicos na população de eritrócitos mais velhos. Sabendo que a população de eritrócitos mais novos se liga com maior afinidade a moléculas de fibrinogénio, pudemos concluir que a população de eritrócitos mais jovens poderá ter a maior contribuição para as doenças cardiovasculares associadas ao aumento dos níveis plasmáticos de fibrinogénio. O vírus da Dengue é o responsável pelo maior número de casos de febre hemorrágica em todo o mundo, sendo estimado que cause mais de 20 mil mortes por ano. Não existe atualmente uma vacina ou tratamento específico para a Dengue, devido (em parte) à falta de conhecimento sobre os mecanismos moleculares de alguns passos importantes do ciclo de vida viral. O vírus da Dengue é do género Flavivirus, família Flaviviridae, à qual também pertencem os vírus da febre-amarela, do Nilo Ocidental e da hepatite C. Apesar de resultarem em patologias e sintomatologias diferentes, os Flaviviridae infetam o fígado e os epitélios vasculares do hospedeiro, podendo também infetar outros órgãos. Nestas infeções, a estiatose hepática é causada pela disfunção geral do metabolismo lipídico, observando-se um aumento do número e tamanho de corpúsculos lipídicos intracelulares, uma desordem da estrutura membranar, bem como a alteração dos níveis e composição das lipoproteínas plasmáticas. Foi recentemente descoberto que a proteína da cápside (C) do vírus da Dengue interage com os corpúsculos lipídicos intracelulares, influenciando a replicação viral. Também se sabe que o vírus da hepatite C forma lipo-viro-partículas, uma conjugação entre lipoproteínas e viriões, sendo mais infeciosas que os próprios vírus livres. Estas evidências mostram a importância dos sistemas lipídicos no ciclo de vida destes vírus, embora os mecanismos moleculares subjacentes à interação da proteína C do vírus da Dengue com estes sistemas lipídicos ainda sejam desconhecidos. O nosso estudo focou-se na importância da interação da proteína da cápside do vírus da Dengue com sistemas lipídicos do hospedeiro (corpúsculos lipídicos e/ou lipoproteínas), que influenciam vários passos importantes do ciclo de vida deste vírus. Através da aplicação da técnica de espectroscopia de força, os resultados obtidos permitiram concluir que a interação da proteína C com corpúsculos isolados de linhas celulares é forte, específica, dependente do ião potássio e de proteína(s) intrínseca(s) dos corpúsculos. De seguida, desenvolveu-se um péptido (pep14-23), homólogo de um segmento da região N-terminal da proteína C do vírus da Dengue, que concluiu-se ter a capacidade de inibir a interação entre a proteína C e os corpúsculos. Tal desenvolvimento permitirá, no futuro, otimizar esta inibição com péptidos derivados do pep14-23, testando a sua atividade anti-viral contra o vírus da Dengue e outros Flavivirus. As interações da proteína C com as lipoproteínas plasmáticas humanas VLDL e LDL foram também testadas, observando-se interação específica apenas com VLDL. A dependência do ião potássio, tal como nos corpúsculos lipídicos, e a especificidade na ligação às VLDL levou a inferir que a interação depende de proteína(s) presentes nas VLDL. Interessantemente, a apolipoproteína E, uma das proteínas das VLDL (e que não está presente nas LDL), tem semelhança estrutural e de sequência com a perilipina 3 (TIP47), uma das proteínas mais abundantes nos corpúsculos lipídicos. Surge então a possibilidade de estes serem os alvos moleculares da proteína C em cada um dos sistemas lipídicos. Este tipo de interação sugere também que o vírus da Dengue, tal como o da hepatite C, pode formar lipo-viro-partículas, o que explicaria alguns dos sintomas da doença.
Descrição: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Funcionais), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/7426
http://catalogo.ul.pt/F/?func=item-global&doc_library=ULB01&type=03&doc_number=000649003
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