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Título: Analysis of the cooperative action of PRC1 and centralspindlin, the two microtubule bundling factors critical for cytokinesis by advanced live cell imaging
Autor: Correia, Guilherme Pereira, 1988-
Orientador: Mishima, Masanori
Gomes, Rui
Palavras-chave: Divisão celular
Biologia molecular
Teses de mestrado - 2012
Data de Defesa: 2012
Resumo: Citocinése em células animais requer um complexo jogo entre o fuso central pós-metafásico e uma série de proteínas regulatórias e moduladoras da dinâmica microtubular (Douglas and Mishima, 2010). Dois factores essenciais para a formação desta estrutura são a proteína PRC1, capaz de agregar microtúbulos, e o complexo centralspindlin (Jiang et al. 1998; Mishima et al. 2002) – um complexo heterotetramérico composto por duas subunidades diméricas: a proteína motora MKLP1 e a RhoGAP (Rho-family GTPase-activating protein) HsCYK-4. Neste trabalho, exploro como estes factores cooperam e qual a relevância da sua interacão para a divisão celular. Versões nativas ou mutadas de HsCYK-4, fundidas com GFP, foram empregadas para estudar a localização desta proteína e para determinar qual a influência da região C-terminal de HsCYK-4 (a região responsável pela interação com a proteína PRC1; Lee and Mishima, unpublished) na divisão celular. Determinou-se que a acumulação do complexo centralspindlin ocorre em duas fases distintas: 1) uma acumulação pré-ingressão da membrana celular, dependente da região C-terminal de HsCYK-4 e 2) uma acumulação pós-ingressão. Quando a primeira fase foi inibida, via ablação da região Cterminal, observou-se um aumento da proporção de células que falhavam a divisão. Isto ocorria devido a uma falha precoce durante o elongamento celular, ou devido a uma falha tardia devida a perda de integridade do corpo médio. Determinou-se que isto, pelo menos em parte, é causado pela formação de fusos centrais anormais com uma organização microtubular comprometida. Também nestas células foi observado que, apesar do complexo centralspindlin e da proteína PRC1 terem mecanismos de recrutamento independentes, a manutenção da sua localização requer a região de interação no C-terminus de HsCYK-4. Este trabalho dá relevância à interação entre centralspindlin e PRC1, tanto para a sua estável localização como para a manutenção da rigidez do fuso central e do corpo médio durante a divisão celular.
Cytokinesis in animal cells requires a complex interplay between the post-metaphase microtubule-based central spindle and several regulatory and microtubule modulating proteins (Douglas and Mishima, 2010). Two protein factors required for the assembly of the central spindle are the microtubule-bundling protein PRC1 and the centralspindlin complex (Jiang et al. 1998; Mishima et al. 2002) – an heterotetramer composed of the motor protein MKLP1 and the RhoGAP (Rho-family GTPase-activating protein) HsCYK-4 subunits. In this work I explore how PRC1 and centralspindlin cooperate and how their interaction leads to a successful cytokinesis. GFP-fused native or mutant versions of the HsCYK-4 protein allowed us to follow centralspindlin localisation and behaviour in vivo, and also determine what influence would the loss of the C-terminal region of HsCYK-4 - the region of PRC1 binding (Lee and Mishima, unpublished) - have on cell division. Centralspindlin accumulation at the middle of the central spindle was found to occur in two stages: a 1) pre-furrow ingression accumulation, heavily dependent on HsCYK-4’s C-terminal region, and a 2) post- furrow ingression accumulation. When the first stage was disrupted, by ablating the C-terminal region of HsCYK-4, an increase in the number of cell division failures was observed. These occurred due to an early failure during elongation of the pole-to-pole distance, or due to a late failure via loss of midbody integrity. This is, in part, caused by the formation of abnormal central spindles with a compromised microtubule organisation. Also, colocalisation between centralspindlin and PRC1 was impaired in these cells, showing that while these molecules have separate targeting mechanisms to the central spindle, the stability of that localisation is dependent on their interacting region. These data point to centralspindlin-PRC1 interaction being essential for the stability of their individual localisation and to maintain the rigidity of the central spindle and midbody during cell division.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/7947
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