Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/8390
Título: Drug screening of Bisnaphthalimidopropyl derivatives on Trypanosoma brucei
Autor: Martins, Patrícia Varela Oliveira,1988-
Orientador: Lima, Sofia Costa
Silva, Marta Sousa
Palavras-chave: Tripanossomíase africana
Trypanosoma
Parasitas
Fármacos
Doença do sono
Teses de mestrado - 2012
Data de Defesa: 2012
Resumo: African trypanosomiasis (AT) is a parasitic vector-borne endemic disease in sub-Saharan Africa and approximately 60 million of people are currently at risk. It is transmitted by the tsetse fly bite. Despite the efforts made by the World Health Organization (WHO) this disease is a continuing problem in Africa. The causative agent is the extracellular protozoan parasite Trypanosoma brucei (T. brucei) which is sub-divided in three subspecies: T. brucei brucei, T. brucei gambiense and T. brucei rhodesiense. The two latter subspecies are responsible for Human African Trypanosomiasis (HAT) also known as sleeping sickness disease, which evolve to the slow onset chronic disease or to the fast onset acute disease, respectively [1, 2]. The current state of drug therapy is limited to five drugs. Suramin and pentamidine are applied against the early phase of the disease denominated as the hemo-lymphatic stage, and melarsoprol, eflornithine and the combination therapy nifurtimox/eflornithine are used against the late meningo-encephalitic stage [3]. However, some drawbacks are associated with these compounds such as their general toxicity to human organism, expensive cost and difficulty in their administration [3-5]. Thus, there is an urgent need for new drugs that are effective against T. brucei, with lower cost, easy to administer, and safer to humans. The anti-parasitic activity on Leishmania infantum (member of the Trypanosomatid family) of bisnaphthalimidopropyl (BNIP) derivative compounds has been described [6-10]. These are composed by two naphthalimidopropyl groups linked by a carbonated chain, varying in size and in the presence of amines, oxygens, cyclohexanes and/or benzene rings. The present work had the objective to evaluate a small library of BNIP-derivative compounds as therapeutic drugs in the treatment of infections caused by T. brucei. At first, an in vitro optimization of two methods to assess parasite growth inhibition [resazurin-based assay and tetrazole 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay] was performed to defined the cell-based drug screening assay towards the bloodstream form T. b. brucei strain Lister 427. Mouse fibroblast L929 cells were used as a counter-screen for non-selective inhibitors determined by the MTT assay. The most potent compound against T. brucei was chosen to determine its reversibility and time kill action, in vivo efficacy on T. brucei-infected BALB/c mice, identification of its putative protein(s) target(s) and development of polyethylene glycol (PEG) – coated poly (lactic acid) (PLA) nanoparticles. In this project, the current used drugs in therapy, pentamidine and suramin, exhibited IC50 (half maximal inhibitory concentration) values against T. brucei of ~4 nM and 70 nM, respectively, in accordance with available literature [11]. From the small 15 BNIP library, 12 compounds exhibited an IC50 in the nanomolar range and it was demonstrated that the presence of two cyclohexane or benzene rings in the linker chain hampers their anti-T. brucei activity. Also it was verified a decrease in the anti-parasitic activity with the increment on the linker chain of the BNIP derivative compounds. BNIPDabut was the most potent compound with ~3 nM activity, similar to the IC50 of pentamidine and with a selectivity index for T. brucei over fibroblasts of about 8000-fold higher. Also, it was characterized as an in vitro trypanocidal compound dependent of concentration and time that is also able to reduce parasite quantity in vivo. Moreover, it exhibits a specific interaction with some T. brucei proteins, in particular with fructose-1,6-bisphosphate aldolase. In addition, BNIPDabut PEG-PLA nanoparticles were successfully produced and are effective in vitro towards T. brucei at the nanomolar range. In conclusion, BNIP-derivative compounds showed promising toxic potential against T. brucei pathogen at low concentrations which can be applied in the future for HAT treatment.
A Tripanossomíase Africana é uma doença parasitária endémica em África, transmitida por um vector, com aproximadamente 60 milhões de pessoas em risco. É transmitida pela picada da mosca tsé-tsé. Apesar dos esforços realizados pela Organização Mundial de Saúde, esta doença permanece um problema em África. O agente causador é um parasita protozoário extracelular denominado Trypanosoma brucei (T. brucei) que está classificado em 3 sub-espécies: T. brucei brucei, T. brucei gambiense and T. brucei rhodesiense. As duas últimas sub-espécies referidas são responsáveis pela Tripanossomíase Humana Africana também conhecida como doença do sono, que se desenvolve com um estabelecimento lento provocando uma forma crónica da doença ou com um estabelecimento rápido e induzindo a forma aguda da doença [1, 2]. Atualmente a terapia está limitada a cinco fármacos. Suramina e pentamidina são aplicadas na fase inicial da doença designada de estadío hemo-linfático, e o melarsoprol, a eflornitina e a terapia combinada entre nifurtimox/eflornitina são usados contra o estadío mais tardio meningo-encefálico [3]. No entanto, alguns inconvenientes estão associados a estes medicamentos tais como a toxicidade geral provocada no organismo humano, o elevado custo e a dificuldade existente na sua administração [3-5]. Portanto, existe uma necessidade urgente de novos fármacos eficazes contra T. brucei, com reduzido custo, fácil administração, e mais seguros para os humanos. A atividade anti-parasitária dos compostos derivados do bisnaftalimidopropilo (BNIP) está descrita em Leishmania infantum (membro da família dos tripanossomatídeos) [6-10]. Estes são constituídos por dois grupos naftalimidopropilo ligados por uma cadeia carbonada, que varia no tamanho e na presença de aminas, átomos de oxigénio, ciclohexanos e/ou anéis de benzeno. O presente trabalho teve como objetivo avaliar um conjunto de compostos derivados do bisnaftalimidopropilo como fármacos terapeuticos no tratamento de infeções causadas por T. brucei. Primeiramente, foi realizada uma optimização in vitro de dois métodos para avaliar a inibição de crescimento parasitário [método baseado na redução de resazurina e método do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)] para definir o processo de screening de compostos na estirpe Lister 427 de T. b. brucei, forma tripomastigota sanguíneo. Os fibroblastos de ratinho L929 foram utilizados para determinar os inibidores não selectivos de células mamíferas pelo método do MTT. O composto mais eficaz contra T. brucei foi seleccionado para determinar o tipo de ação (reversível ou irreversível) e tempo de morte, eficácia in vivo em ratinhos BALB/c infectados com T. brucei, identificação da(s) proteína(s) alvo do composto mais promissor e desenvolvimento de nanopartículas poli(ácido láctico)-polietilenoglicol para o mesmo. Neste projeto, os fármacos utilizados na terapia atual, pentamidina e suramina exibiram valores de concentração inibitória de 50% (IC50) da população de T. brucei de aproximadamente 4 nM e 70 nM, respectivamente, e estão de acordo com a literatura [11]. Dos 15 compostos BNIP testados, 12 apresentaram atividade na ordem dos nanomolar e foi demonstrado que a presença de dois anéis de ciclohexano ou benzeno na cadeia de ligação diminui a sua actividade anti-T. brucei. Também foi verificada uma perda na actividade anti-parasitária com o aumento da cadeia de ligação dos compostos derivados BNIP. BNIPDabut foi o composto mais eficaz com actividade antiparasitária de aproximadamente 3 nM, semelhante ao IC50 da pentamidina e com um índice de selectividade em T. brucei relativamente a fibroblastos cerca de 8000 vezes superior. Adicionalmente, foi caracterizado in vitro como um composto tripanocida dependente do tempo e da concentração que, também tem a capacidade de reduzir a quantidade de parasitas in vivo. Induz ainda uma interação específica com algumas proteínas de T. brucei, em particular com a frutose-1,6-bifosfato aldolase. Além disso, nanopartículas de BNIPDabut encapsulado em poli(ácido láctico)-polietilenoglicol foram produzidas com sucesso e foram eficazes in vitro contra T. brucei na ordem dos nanomolar. Concluindo, os compostos derivados do bisnaftalimidopropilo mostraram um potencial tóxico promissor em concentrações reduzidas contra o patogénio T. brucei, que podem ser aplicados futuramente no tratamento da Tripanossomíase Humana Africana.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/8390
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