Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/8713
Título: Development of cell-based techniques to select and evolve recombinant antibodies
Autor: Oliveira, Soraia Rafaela Santiago de, 1984-
Orientador: Gonçalves, João, 1967-
Palavras-chave: Teses de doutoramento - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Monoclonal antibodies are excellent biopharmaceutical, diagnostic and research reagents due to their high antigen affinity and specificity. Current antibody selection techniques have limited success in the isolation of specific, high affinity antibodies that target receptor proteins on cell surface or receptor-ligand interactions. The affinity of selected antibodies often has to be improved by complementary methods, making antibody discovery extremely time-consuming and expensive. In this thesis, we developed three strategies to address these technical issues. First, we tested the efficacy of three different strategies for the construction of bivalent single-domain antibody libraries (Chapter II). The restriction/ligation strategy was the best one, but all of them resulted in antibodies with an increased binding to the antigen due to an increased avidity. Second, we developed a novel cell-based biosensor assay to detect all type of modulators (including antibodies) of protein-protein interactions at the cell surface (Chapter III). It relies on the activation of a reporter gene when two recombinant transmembrane proteins interact at the cell surface. One of these proteins contains a protease in its intracellular domain, and the other a protease cleavage site and a transcriptional activator. When the extracellular domains interact or are brought together (e.g. by an antibody), the protease releases the transcriptional activator, which in turn triggers the expression of the reporter gene. Finally, we developed a new cell-based platform that allows simultaneous selection and maturation of both neutralizing and binding antibodies (Chapter IV). It is based on the expression of antibodies/ligands in the endoplasmic reticulum, and on the co-expression of a mutagenic protein to introduce variability in the antibody pool. Antibody selection is then easily monitored by flow cytometry. We believe our strategies will contribute greatly to the process of antibody discovery and development, and therefore to the improvement of therapy, diagnosis and research in human disorders.
A biotecnologia é uma área em forte expansão desde o início do seculo XX. Conjuga o conhecimento sobre os sistemas biológicos, organismos vivos ou derivados, com o desenvolvimento de novas tecnologias e produtos para usos específicos. Tem diversas aplicações ao nível da agricultura, meio ambiente e medicina. Nesta última, a biotecnologia tem desempenhado um papel importante na investigação, diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças. Nestas áreas os anticorpos tem demonstrado ser ferramentas fundamentais e, cada vez mais, com maior aplicação, devendo-se o seu enorme sucesso as suas características. Os anticorpos são moléculas estáveis que reconhecem com elevada afinidade o seu antigénio, podendo funcionar como recetores que medeiam a própria ativação dos linfócitos B ou como mediadores da imunidade humoral. São facilmente manipuláveis por engenharia genética, podendo o seu tamanho ser modificado e a sua função alterada mediante a fusão com proteínas, toxinas ou outros anticorpos. Deste modo, desde a sua descoberta como compostos terapêuticos por Kitasato e von Behring, tem sido desenvolvidos esforços para produzir e selecionar anticorpos cada vez mais fortes e eficazes. Contudo, as técnicas que se encontram disponíveis para selecionar anticorpos e posteriormente melhorar a afinidade e a estabilidade destes apresentam algumas limitações. Muitas dessas técnicas não são realizadas num ambiente de uma célula eucariota, comprometendo assim a conformação final, tanto das proteínas alvo como dos anticorpos; a proteína alvo e utilizada purificada, não havendo garantias de estar na sua conformação correta; não permitem a seleção de anticorpos que inibem interações recetor-ligando; e não combinam num só sistema seleção e maturação da afinidade. Além do mais, muitos dos anticorpos selecionados necessitam de ser posteriormente modificados para melhorar a sua afinidade, estabilidade, expressão, difusão na corrente sanguínea ou função. Deste modo, todo o processo de produção e descoberta de um anticorpo eficaz torna-se cada vez mais lento. É então pertinente, desenvolver novas técnicas que permitam: aumentar a afinidade e estabilidade de anticorpos já selecionados, especialmente quando estes são de pequeno tamanho; detetar anticorpos que interfiram com interações proteína-proteína; ou combinar, num só sistema, selecção, maturação da afinidade e expressão de anticorpos. Por haver esta necessidade por parte da indústria e academia, esta dissertação de Doutoramento teve por objetivo o desenvolvimento de novas técnicas celulares para selecionar anticorpos estáveis, de elevada afinidade e expressão contra qualquer tipo de antigénio. Numa primeira abordagem (Chapter II) pretendeu-se comparar e avaliar a eficácia da construção de bibliotecas de anticorpos de domínio único bi-valentes. Testaram-se três técnicas moleculares diferentes: PCR overlap, sticky PCR e restriction/ligation. Verificou-se que todas elas levaram a uma construção eficiente de dímeros de anticorpos de domínio único e que estes apresentavam uma maior força de ligação do anticorpo ao antigénio devido a um aumento da avidez. A variante que melhores resultados apresentou, tanto ao nível da construção da biblioteca como da seleção de anticorpos dimerizados com uma força de ligação superior a dos monómeros, foi a que envolveu hidrólise e ligação dos fragmentos de anticorpos (restriction/ligation). Observou-se também que o tamanho do linker entre os dois anticorpos de domínio único, que constituem o dímero, não afetou a eficiência da construção das bibliotecas, nem a estabilidade destes. Deste modo, provou-se que se pode selecionar dímeros de anticorpos de domínio único a partir de bibliotecas de anticorpos cujas características não se conhecem. Algo inovador no sentido em que atualmente todos os anticorpos dimerizados/multimerizados são construídos a partir de anticorpos já caracterizados. Numa segunda abordagem (Chapter III), desenvolvemos uma técnica celular capaz de detetar todo o tipo de modeladores de interações proteína-proteína a superfície de células de mamífero. Esta técnica consiste na coapresentação, a superfície de células, de duas proteínas recombinantes em que os domínios extracelulares e transmembranares são constituídos pelas proteínas em estudo e os domínios intracelulares integram um sistema repórter ativado em caso de dimerização dos domínios extracelulares. Esse sistema e composto por um gene repórter sob o controle de um promotor induzível, por uma protease e por um ativador da transcrição que atua especificamente no promotor desse gene. Esta estratégia foi validada através do uso de proteínas que interagem naturalmente (hTNF-α), por meio de um ligando natural (hEGFR) ou de um anticorpo (hCD4). Verificou-se a eficiência da estratégia por um aumento da indução do sistema repórter aquando a interação entre os domínios extracelulares. Os resultados demonstram que esta técnica pode ser uma ferramenta valiosa como sistema de identificação e screening de anticorpos e de outros modeladores (ligandos ou inibidores) que interfiram com interações proteína-proteína, podendo ser extremamente útil para a pesquisa e avaliação de novos compostos terapêuticos ou de diagnóstico. Por último, desenvolvemos uma estratégia celular inovadora que combina seleção e maturação de anticorpos (Chapter IV). Esta estratégia baseia-se na expressão de ligandos ou anticorpos em fusão com uma sequência de retenção no reticulo endoplasmático (KDEL) de células de mamífero, de acordo com o tipo de anticorpos a selecionar, neutralizantes ou de ligação. Os anticorpos neutralizantes caracterizam-se por inibir a interação entre recetor e ligando e os anticorpos de ligação por reconhecerem a proteína alvo, independentemente de ser num local onde o ligando se ligue. Para selecionar anticorpos neutralizantes constrói-se inicialmente uma linha celular a coexpressar um recetor e um ligando de interesse que se encontra em fusão com a sequência de retenção no reticulo endoplasmático KDEL. Deste modo, devido a forte interação entre ligando e recetor, este complexo e retido no reticulo endoplasmático, não havendo apresentação do recetor a superfície da célula. Estas células são então transduzidas com anticorpos, que no seu processo de formacao, passam pelo reticulo endoplasmático. Se algum dos anticorpos for neutralizante, o recetor e liberto e expresso a superfície celular, permitindo a sua deteção e posterior seleção. Para selecionar anticorpos de ligação constrói-se uma linha celular, a expressar a proteína alvo a superfície das células, que e posteriormente transduzida com anticorpos em fusão com a sequência de retenção no reticulo endoplasmático KDEL. Se algum dos anticorpos reconhecer e se ligar eficientemente a proteína alvo durante a sua formação, esta ficará retida no reticulo endoplasmático diminuindo a sua expressão à superfície das células. Para validar ambas as variantes selecionou-se o hTNF-α e o seu recetor como modelo, uma vez que já se dispunha de anticorpos que reconheciam estes alvos. Para além da seleção de anticorpos, também se testou com sucesso a introdução de uma proteína mutagénica (hAID) no sistema, para introduzir variabilidade no anticorpo e contribuir para a evolução da sua afinidade. O aumento ou diminuição da expressão de moléculas à superfície da célula foi detetado e selecionado por citometria de fluxo. Conseguimos deste modo, construir uma técnica inovadora que integra, num só sistema os passos da seleção de anticorpos, maturação da afinidade e capacidade de bloquear a interação entre recetor-ligando. Com o trabalho desenvolvido ao longo deste Doutoramento, pretende-se contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias biotecnológicas que permitam revolucionar a tecnologia dos anticorpos, desde o seu processo de descoberta até à sua colocação no mercado, tornando todo este processo mais célere e eficaz.
Descrição: Tese de doutoramento, Farmácia (Biotecnologia Farmacêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/8713
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