Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/8882
Título: Molecular characterisation of the poorly differentiated and undifferentiated thyroid carcinomas using genome-wide approaches
Autor: Pita, Jaime Miguel Gomes, 1985-
Orientador: Leite, Valeriano, 1958-
Cyrne, Luísa, 1954-
Palavras-chave: Glândula tiróide
Tumores
Expressão genética
Mutação (Biologia)
MicroRNA
Teses de doutoramento - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Poorly differentiated (PDTC) and anaplastic thyroid carcinomas (ATC) are highly malignant tumours composed by dedifferentiated cells, for which current therapeutic options have been ineffective. In the present project, the molecular signatures and genetic alterations associated with these tumours were elucidated, by using genome-wide expression analysis as first assessment. The role of the microRNA stability in thyroid tumourigenesis was also evaluated. The comparison of the expression profiles between PDTC, well-differentiated thyroid carcinomas and normal thyroid tissues, and between ATC and normal thyroid tissues, revealed that PDTC and ATC have common deregulated signatures, indicative of cell adhesion impairment and increased cell cycle, proliferation and chromosomal instability. Additionally, ATC were specifically characterized by loss of epithelial and thyroid-related functions and activation of components from TGF-β pathway. The gene expression data suggested that follicular variants of papillary carcinomas were possible precursors of PDTC, whereas, ATC were more similar to classical papillary carcinomas. Validation by quantitative RT-PCR in independent sample sets, allowed to confirm the significant over-expression of UHRF1 (associated to proliferation) and downregulation of ITIH5 (associated to cell adhesion and invasion) in PDTC relatively to normal tissues. Moreover, CDKN3 gene, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor, was shown to be significantly upregulated in PDTC and ATC relatively to normal thyroid, and in accordance with its suppressive function, CDKN3 was aberrantly spliced in ATC samples. The over-expression of the epithelial-tomesenchymal transition factor SNAI2, which is induced by TGF-β, was significant in ATC. Attending to the deregulated pathways identified, a mutational screening was undertaken in 26 ATC and 22 PDTC, which included the hot-spot regions of RAS, BRAF, TP53, CTNNB1 (β-catenin) and PIK3CA genes, and, for the first time, a comprehensive mutational analysis of cell cycle [CDKN1A (p21CIP1); CDKN1B (p27KIP1); CDKN2A (p14ARF, p16INK4A); CDKN2B (p15INK4B); CDKN2C (p18INK4C)], and cell adhesion regulators (AXIN1). Most mutations were identified in TP53 (42% of ATC; 27% of PDTC) and in RAS (31% of ATC; 18% of PDTC). The alterations in these genes were mutually exclusive (P=0.0354), and were associated with a lower patient survival (P=0.0383). CDKN2A and CDKN2B were found to be mutated, for the first time, in up to 25% of PDTC. Other known recurrent mutations in ATC (in BRAF, PIK3CA, CTNNB1 and AXIN1 genes) were rarely detected, undermining their role in ATC development. The study of the microRNA stability in thyroid tumourigenesis is still ongoing. Turnover rates were determined in a dedifferentiated thyroid carcinoma cell line (BCPAP), under standard conditions. A non-disruptive pulse-labelling method was applied and the decrease in microRNA expression along the time was quantified by two-colour arrays. These results represent the first report for an atlas of human microRNA half-lives. The determined average half-life for 249 microRNA was 2.5 days, a stability time more comparable to proteins than to mRNA. The comparison of these data with decay rates in normal thyroid cells will probably uncover miRNA for which stability is deregulated. In conclusion, this project presents several genes and molecular events that were found deregulated in PDTC and ATC. More importantly, these represent potential therapeutic targets that can be used for the treatment of these highly aggressive tumours, in the near future.
O cancro da tiróide constitui a neoplasia mais comum do sistema endócrino (van der Zwan et al., 2012), representando nos homens e nas mulheres respectivamente, cerca de 1 e 3% dos casos de cancro, estimados em Portugal (Ferlay et al., 2010a) e no mundo (Ferlay et al., 2010b). Os tumores com origem no epitélio folicular representam 90 a 95% das neoplasias da tiróide (Nikiforov and Nikiforova, 2011), e de acordo com as características morfológicas e clínicas, os tumores foliculares malignos são subdivididos em carcinomas bem-diferenciados (WDTC), carcinomas pouco diferenciados (PDTC) e carcinomas indiferenciados ou anaplásicos (ATC). Os tumores foliculares da tiróide representam assim, um modelo clássico do processo tumoral pelo qual uma célula epitelial possui potencial para originar diferentes tipos de tumores, cada um com características patológicas distintas. Nos WDTC incluem-se os carcinomas papilares (PTC) e os carcinomas foliculares (FTC), sendo os PTC os mais frequentes, representando cerca de 80 a 90% dos casos (Kondo et al., 2006; Nikiforov and Nikiforova, 2011). Os WDTC são, em geral, tratados eficazmente com cirurgia e iodo radioactivo, e cerca de 90% dos doentes com menos de 45 anos ficam curados (DeLellis et al., 2004). Por outro lado, os PDTC e os ATC apresentam escassa diferenciação folicular e comportam-se de forma altamente agressiva. Em particular, os ATC apresentam uma progressão clínica muito rápida, e em geral, manifestam no diagnóstico inicial, uma extensa invasão dos tecidos adjacentes e metástases à distância, nomeadamente pulmonares, ósseas ou cerebrais (Muro-Cacho and Ku, 2000; DeLellis et al., 2004). Apesar dos ATC contribuírem apenas para 1 a 2% dos tumores da tiróide (Kondo et al., 2006; Nikiforov and Nikiforova, 2011), são responsáveis por 14 a 50% das mortes relacionadas com cancro da tiróide. Estão associados a uma sobrevivência média de 3 a 5 meses (DeLellis et al., 2004; Nagaiah et al., 2011), representando assim uma das neoplasias mais letais. Os PDTC apresentam características morfológicas e clínicas intermédias entre os WDTC e ATC (Lam et al., 2000; Volante et al., 2004; Sanders et al., 2007; Nambiar et al., 2011). A taxa média de sobrevida aos 5 anos, dos doentes com PDTC é de cerca de 50% e a mortalidade deve-se sobretudo a metástases pulmonares e ósseas (DeLellis et al., 2004; Nambiar et al., 2011). Os PDTC e em especial, os ATC, são refractários às formas convencionais de tratamento (cirurgia e iodo radioactivo). Na maioria dos casos, a ressecção dos tumores não é viável e a quimio- e a radioterapia demonstram um efeito reduzido na sobrevivência dos doentes (Sanders et al., 2007; Smallridge et al., 2009; Abate and Smallridge, 2011). Assim, é de extrema importância a implementação de novas modalidades terapêuticas que sejam eficazes nestas neoplasias. A transformação do epitélio folicular da tiróide resulta tipicamente de alterações genéticas que envolvem componentes das vias de sinalização MAPK-ERK e PI3K-AKT, essenciais na regulação da proliferação e homeostasia celular. Nos PTC detectam-se, de forma mutuamente exclusiva (Kimura et al., 2003; Nikiforov and Nikiforova, 2011), mutações activantes nos genes que codificam a cinase de serina/treonina BRAF e as GTPases H-, K- e NRAS, sendo a mutação do gene BRAF a alteração mais frequente (Kimura et al., 2003; Fugazzola et al., 2006). Entre os WDTC, as mutações nos genes RAS estão associadas a tumores com morfologia folicular, sendo detectadas na variante folicular dos PTC e em FTC (Vasko et al., 2003; Zhu et al., 2003; Di Cristofaro et al., 2006). As características clínicas e histológicas dos carcinomas da tiróide sugerem uma contínua perda da diferenciação celular (um processo de desdiferenciação) pelo qual ocorre um aumento progressivo da agressividade. Considera-se que os PDTC e ATC possam surgir directamente a partir da célula folicular ou derivarem de tumores pré-existentes. Este último modelo é apoiado pela frequente detecção de áreas bem-diferenciadas em casos de PDTC e ATC (Nikiforova et al., 2003a; DeLellis et al., 2004; Quiros et al., 2005; Takano et al., 2007a; Wang et al., 2007a; Santarpia et al., 2008; Ricarte-Filho et al., 2009). Várias evidências moleculares sugerem, de igual modo, que os WDTC podem progredir para PDTC e para ATC. A detecção dos oncogenes RAS e BRAF em casos de PDTC e ATC (Garcia- Rostan et al., 2003; Smallridge et al., 2009; Volante et al., 2009) e a presença destas mutações em componentes diferenciadas e indiferenciadas de um mesmo tumor (Oyama et al., 1995; Nikiforova et al., 2003a; Begum et al., 2004; Cohen et al., 2004; Takano et al., 2007a; Costa et al., 2008; Schwertheim et al., 2009), sugerem um processo de progressão a partir de WDTC. Além disso, estas mutações podem coexistir com alterações no gene supressor de tumores TP53 (Lam et al., 2000; Quiros et al., 2005; Wang et al., 2007), no gene CTNNB1 que codifica o efector β-catenina da via WNT (Garcia-Rostan et al., 2001) e no PIK3CA que codifica a subunidade catalítica da cinase PI3K da via PI3K-AKT (Lam et al., 2000; Garcia-Rostan et al., 2001; Garcia-Rostan et al., 2005; Quiros et al., 2005; Hou et al., 2007a; Wang et al., 2007a; Liu et al., 2008; Santarpia et al., 2008; Ricarte-Filho et al., 2009). Estas alterações, que são detectadas exclusivamente, ou com maior frequência em PDTC e ATC, demonstram, assim, a acumulação e a cooperação de eventos específicos durante a desdiferenciação. Os microRNA (miRNA), que com frequência se encontram desregulados no processo oncogénico (Calin and Croce, 2006), podem apresentar padrões de expressão anómalos nos tumores da tiróide (Nikiforova et al., 2009). Cada um destes RNA, que são não-codificantes, pode estar envolvido na regulação de centenas de transcriptos-alvo, mediando a sua degradação ou a repressão da translacção proteica (Carthew and Sontheimer, 2009). Assim, os miRNA podem constituir potenciais agentes terapêuticos, na medida em que afectam simultaneamente várias vias de sinalização, impedindo os mecanismos compensatórios das células tumorais (Lujambio and Lowe, 2012). Os níveis de expressão dos miRNA numa célula são o resultado tanto da sua biossíntese como da sua degradação. Enquanto que a via de biossíntese se encontra bem caracterizada (Cullen, 2006), o processo de degradação e o tempo de semi-vida dos miRNA, são relativamente desconhecidos. A determinação da estabilidade e a caracterização dos factores que influenciam a degradação destas moléculas, representam, portanto, áreas importantes para a investigação da potencial utilidade terapêutica dos miRNA. A análise de expressão génica global no campo da oncologia demonstrou ser vantajosa no prognóstico e classificação dos tumores, assim como, na identificação de potenciais alvos terapêuticos (Chung et al., 2002; Nevins and Potti, 2007). Esta metodologia tem sido extensivamente utilizada na tiróide, especialmente no estudo dos diferentes subtipos de WDTC (Griffith et al., 2006; Riesco-Eizaguirre and Santisteban, 2007). No caso dos PDTC e ATC, a análise da expressão génica global em tumores primários encontra-se restrita a poucos estudos. A comparação dos perfis de expressão de ATC e PDTC com WDTC e tecido tiroideu normal (TN) permitiu identificar assinaturas moleculares relacionadas com a proliferação e ciclo celular, instabilidade cromossómica, adesão, motilidade celular e perda da função tiróidea (Salvatore et al., 2007; Montero-Conde et al., 2008; Hébrant et al., 2012). Com o objectivo de elucidar os mecanismos envolvidos na progressão e na agressividade dos PDTC e ATC e identificar novos alvos para o tratamento destes tumores, compararam-se os perfis de expressão génica globais de amostras de TN e de WDTC com PDTC e ATC. Tendo em conta os resultados obtidos, procedeu-se a uma extensa pesquisa de mutações em genes envolvidos em processos celulares desregulados nos PDTC e ATC, e correlacionaramse os dados obtidos com os aspectos clínico-patológicos dos doentes. Por fim, o estudo do turnover de RNA através da marcação com um análogo da uridina (4-tiouridina), foi usado para determinar os tempos de semi-vida de miRNA numa linha celular de carcinoma desdiferenciado da tiróide. A comparação da expressão génica global entre 5 PDTC, 19 WDTC e 3 TN, e entre 5 ATC e 4 TN revelou que os PDTC e ATC exibem, em comum, genes desregulados com expressão aumentada associados ao ciclo celular, proliferação celular, segregação cromossómica e ao “checkpoint” do fuso mitótico, enquanto que, os genes sub-expressos estavam principalmente relacionados com a adesão celular. Os ATC apresentaram como eventos específicos (ausentes na análise dos PDTC), o aumento de expressão de componentes da via do TGF-β e a sub-expressão de genes associados à função e metabolismo tiroideu, à morfologia epitelial e às junções celulares. A análise não-supervisionada da semelhança génica entre as amostras e a correlação com a pesquisa de alterações do RAS e BRAF, demonstrou que as variantes foliculares de PTC são os precursores mais prováveis dos PDTC com mutação no gene RAS. Por outro lado, a comparação dos genes diferencialmente expressos em cada tipo de tumor em relação ao tecido normal, permitiu avaliar que os ATC partilhavam maior número de genes com os PTC clássicos do que com os restantes tumores, o qual suporta a provável origem dos ATC a partir dos PTC clássicos. A análise dos genes diferencialmente expressos entre cada tipo de tumor e o TN revelou que 307 de 494 (60%) dos genes eram sobre-expressos em PTC, enquanto que 137 de 171 (80%) estavam subexpressos em FTC, 92 de 107 (86%) estavam sub-expressos em PDTC e 983 de 1333 (74%) estavam com expressão diminuída nos ATC. Validaram-se por RT-PCR quantitativo em grupos independentes de tumores, o gene UHRF1, associado à proliferação e identificado como sobre-expressos nos PDTC em relação ao tecido normal e o gene ITIH5, relacionado com a adesão celular e sub-expresso nos PDTC em relação ao tecido normal. Adicionalmente, caracterizou-se o gene CDKN3, o qual codifica um inibidor das cinases dependentes de ciclina (CDK) que foi identificado, na análise de expressão, como o gene mais sobre-expresso nos ATC, tendo-se confirmado a sua expressão aumentada em ATC, bem como em PDTC relativamente ao TN. De acordo com a sua função supressora de tumor, observou-se uma expressão significativa de formas de splicing aberrantes apenas nos ATC. Devido ao papel importante que a activação da via do TGF-β apresenta na promoção da transição epitelial-mesenquimal (EMT) (Huber et al., 2005), validou-se a expressão do gene SNAI2, regulador do EMT, e cuja expressão é induzida por esta via (Xu et al., 2009). Confirmou-se assim, a sobre-expressão específica deste gene em ATC. Tendo em conta os resultados obtidos nos estudos de expressão génica global dos PDTC e ATC, procedeu-se a uma extensa análise mutacional em genes envolvidos na regulação do ciclo celular como os inibidores de CDK [CDKN1A (p21CIP1), CDKN1B (p27KIP1), CDKN2A (p14ARF, p16INK4A), CDKN2B (p15INK4B) e CDKN2C (p18INK4C)], genes envolvidos na adesão celular (AXIN1, que codifica um regulador negativo da via WNT) e genes cujo envolvimento nestes tumores fora previamente descrito (H-, K-, NRAS, BRAF, PIK3CA, TP53 e CTNNB1). A pesquisa de alterações patogénicas em 26 ATC e 22 PDTC revelou que as mutações dos genes TP53 (presentes em 42% dos ATC e 27% dos PDTC) e RAS (presentes em 31% dos ATC e 18% dos PDTC) são as mais frequentes nestes tumores. As mutações nestes genes apresentaram mútua exclusividade (P=0,0354) e a sua presença estava associada a um menor tempo de sobrevida global dos doentes com PDTC e ATC (P=0,0383). No caso dos inibidores de CDK identificou-se, pela primeira vez, que alterações nos genes CDKN2A e CDKN2B podem estar envolvidos em cerca de 25% dos PDTC. Por outro lado, as mutações previamente descritas como frequentes em ATC, tais como BRAF, PIK3CA, AXIN1 ou CTNNB1 (Smallridge et al., 2009), foram identificadas em menos de 8% dos casos. O método não-disruptivo de marcação de RNA com 4-tiouridina, foi optimizado e utlizado, pela primeira vez, no estudo da estabilidade dos miRNA. A incubação de uma linha celular de tumor desdiferenciado da tiróide (BCPAP), com 200 μM 4-tiouridina durante 24 horas, revelou não ser tóxico para as células, não afectar a expressão dos miRNA e permitiu marcar, purificar e quantificar os miRNA de forma precisa. Recorrendo a “arrays” de expressão de miRNA, obtiveram-se os tempos de semi-vida para 249 miRNA, cujo tempo médio foi de 2,5 dias, variando desde 22 horas (miR-208a e miR-107) até mais de 5,5 dias (miR-1321 e miR-320d). Estes dados revelam que os miRNA apresentam uma maior estabilidade que os RNA mensageiros (Yang et al., 2003; Friedel et al., 2009), sendo comparável à estabilidade proteica (Boisvert et al., 2012). O nosso estudo encontra-se em desenvolvimento mas, pretende-se identificar os factores determinantes para a degradação de miRNA. Em especial, a comparação destes dados com tempos de semi-vida determinados em células normais da tiróide, permitirá identificar miRNA cuja estabilidade se encontra desregulada no processo oncogénico. Em suma, no presente trabalho identificaram-se várias vias e genes que poderão representar alvos para intervenção terapêutica, com impacto no seguimento clínico e na sobrevivência de doentes com tumores agressivos, como são os PDTC e ATC.
Descrição: Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/8882
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