Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/9054
Título: Fluorescence studies of protein aggregation leading to amyloid formation: the role of anionic lipid membranes
Autor: Ricardo, Joana Catarina Ribeiro
Orientador: Coutinho, Ana Isabel Abrantes, 1965-
Palavras-chave: Lisozima
Alexa 488
Microscopia e espectroscopia de fluorescência
Formação de fibras amilóide
Interacção lípido-proteína
Sistemas modelo de membranas
Teses de mestrado - 2012
Data de Defesa: 2012
Resumo: Existem diversas doenças humanas, tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson ou a diabetes mellitus tipo II, em que ocorre a formação de depósitos proteicos intra- ou extracelulares designados por fibras amilóide. Os processos que levam as proteínas a sofrer alterações conformacionais que transformam o seu estado nativo num estado parcialmente desnaturado que, posteriormente, conduz a processos irreversíveis de agregação são ainda pouco conhecidos mas de elevado interesse para a comunidade científica. Alguns destes processos podem ser semelhantes ao que ocorre com formulações proteicas desenvolvidas pela indústria farmacêutica durante o seu armazenamento. Deste modo, é urgente esclarecer os mecanismos moleculares que conduzem à agregação e formação de fibras pelas proteínas, assim como determinar a estrutura das fibras amilóides e dos intermediários seus precursores, de modo a ser possível desenvolver compostos eficazes para o tratamento destas doenças e para a preservação dos fármacos. Actualmente pensa-se que a toxicidade associada a estas doenças provém não das fibras amilóides maduras propriamente ditas mas sim dos seus precursores. Vários estudos recentes apontam para o facto de estes intermediários serem capazes de interagir com as membranas biológicas, o que pode levar à disrupção das mesmas. Com efeito, a capacidade que as membranas lipídicas aniónicas têm em recrutar e induzir alterações conformacionais em diversos péptidos/proteínas amiloidogénicas, que podem levar à formação de agregados com características amilóides, tem sido um tópico de investigação importante nos últimos anos. Em 2004, Kinnunen e colaboradores alargaram este conceito ao propor que as membranas contendo fosfolípidos acídicos podem também desencadear a fibrilhação de várias proteínas não amiloidogénicas, tais como o lisozima e a mioglobina. O lisozima da clara do ovo de galinha (HEWL) é um modelo ideal de uma proteína não amiloidogénica para investigar esta hipótese já que tem sido largamente usado no estudo dos mecanismos moleculares de agregação de proteínas/ formação de fibras in vitro. O presente trabalho visou prosseguir o estudo iniciado no laboratório de acolhimento relativamente ao mecanismo de fibrilhação do HEWL induzido pela sua interação com membranas lipídicas aniónicas. De modo a ser possível aplicar uma grande variedade de técnicas centradas na espectroscopia de fluorescência (medidas em estado estacionário e resolvidas no tempo, assim como a espectroscopia de correlação de fluorescência), a proteína foi derivatizada com uma sonda fluorescente, o éster de succinamida do Alexa 488 (A488). Os estudos foram realizados com sistemas modelo de membranas, vesículas unilamelares grandes (LUVs), preparadas com uma composição lipídica variável, nomeadamente incluindo diferentes percentagens de um fosfolípido zwitteriónico e aniónico (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoserina (POPS)), respectivamente). Os estudos iniciais realizados evidenciaram que as propriedades de emissão de fluorescência do HEWL derivatizado com A488 (Lz-A488) eram fortemente afectadas quando esta interactuava com lipossomas aniónicos. Tendo por base as variações registadas nos valores dos comprimentos de onda máximos de emissão, intensidade e tempos de vida de fluorescência, foi possível identificar três populações distintas de Lz-A488 em interacção com as membranas, dependentes da razão lípido:proteína usada nos ensaios. Atendendo aos resultados obtidos, sugeriu-se que as populações detectadas poderiam corresponder a intermediários da via de fibrilhação do lisozima induzida pela sua interação com membranas lipídicas aniónicas. Tendo em conta que as conclusões anteriores são baseadas nas propriedades de emissão de fluorescência do A488, tornou-se imperativo avaliar a capacidade deste fluoróforo em reportar alterações conformacionais sofridas pelo lisozima quando sujeito a condições destabilizadoras. Deste modo, o presente trabalho foi iniciado com a realização de estudos de desnaturação térmica do Lz-A488 através da monitorização da variação das suas propriedades de emissão de fuorescência com a temperatura. Os estudos foram realizados a pH 7.4 e 2.2 já que enquanto as interacções lípido-proteína são habitualmente investigadas a pH neutro, os estudos de fibrlhação in vitro desta proteína são frequentemente conduzidos a valores de pH acídicos. Após marcação covalente do lisozima com o A488 e sua posterior purificação por cromatografia de exclusão molecular, confirmou-se que a proteína modificada mantém a sua estrutura nativa à temperatura ambiente através da comparação dos tempos de correlação rotacional obtidos a ambos os valores de pH. Os ensaios de desnaturação térmica efectuados revelaram que o fluoróforo é um bom grupo repórter das alterações conformacionais sofridas pelo lisozima devido à sua susceptibilidade em sofrer extinção de fluorescência via um mecanismo de transferência de electrões foto-induzida. Os resíduos W62 e W63 do lisozima são candidatos potenciais a actuarem como agentes de extinção de fluorescência do fluróforo ligado covalentemente ao resíduo K97 já que se encontram localizados numa região da proteína que tem sido descrita como sendo a primeira a sofrer alterações conformacionais por aumento da temperatura. Os resultados obtidos mostraram ainda que a derivatização da proteína não perturba o seu nível terciário de estrutura de um modo pronunciado pois os valores obtidos para a temperatura de desnaturação térmica do Lz-A488 são concordantes com dados da literatura obtidos por outras técnicas biofísicas. O passo seguinte deste trabalho consistiu em estudar de que modo a fibrilhação in vitro do lisozima afectava as propriedades emissivas do Lz-A488. Os ensaios foram efectuados a pH 2.2 e 57 ºC, sob condições quiescentes. Foram preparadas misturas de lisozima com proporções variáveis de proteína marcada (razões molares de 1/2, 1/8, 1/40, 1/100 e 1/200 Lz-A488/lisozima, concentração de proteína total 0.2 ou 1.0 mM). Em paralelo, foram realizados ensaios controlo da cinética de fibrilhação do lisozima não derivatizado empregando-se as sondas tioflavina T (ThT) e vermelho do Nilo (NR). De acordo com o esperado, as cinéticas apresentaram um comportamento sigmóide característico de um mecanismo do tipo nucleação-polimerização, tendo-se determinado um tempo de latência cerca de 2 dias mais longo para as amostras contendo menor concentração de proteína total. A obtenção de fibras amilóide maduras que ligavam ThT e NR foi confirmada por microscopia confocal de fluorescência (CFM) no final de ambas as cinéticas. Foi ainda determinado que o NR apresenta uma afinidade moderada na sua ligação às fibras amilóide maduras de lisozima (Kd~ 2.0 M) através da análise das medidas de anisotropia de fluorescência do NR resolvidas no tempo de acordo com um modelo associativo. Em todas as misturas Lz-A488/lisozima ensaiadas confirmou-se que o lisozima marcado era incorporado nas fibras amilóides maduras através da realização de medidas de CFM. As medidas de anisotropia em estado estacionário e resolvidas no tempo do Lz-A488 revelaram-se extremamente informativas já que permitiram identificar as três fases das cinéticas de fibrilhação de todas as misturas Lz-A488/lisozima, expecto a 1/2. Os tempos de duração das diferentes fases correlacionaram-se bem com os indicados pelas sondas ThT e NR nos ensaios controlo. No caso da mistura 1/2, a anisotropia em estado estacionário do Lz-A488 manteve-se praticamente constante ao longo dos 14 dias de incubação da amostra, resultado este que foi atribuído à ocorrência de migração de energia (homotransferência) entre as proteínas marcadas. Finalmente, os tempos de vida de fluorescência menores medidos para o Lz-A488 incorporado nas fibras amilóides preparadas a partir de amostras contendo proporções mais elevadas de Lz-A488/lisozima (1/2 e 1/8) indicam que a presença de uma grande quantidade de proteína derivatizada na amostra inicial perturba o empacotamento final do Lz-A488 nas fibras. Por último, estudou-se a capacidade da sonda ThT em reportar a fibrilhação do lisozima na presença de vesículas lipídicas aniónicas. Devido ao seu carácter catiónico, era expectável que esta sonda se ligasse a membranas lipídicas carregadas negativamente, o que foi confirmado através da realização de um estudo da sua partição para lipossomas de POPC contendo proporções variáveis de POPS (10, 20 e 30 mol%) por medidas de fluorescência. Foram também realizados estudos de ligação da sonda ao lisozima monomérico e a fibras amilóide pré-formadas pelo lisozima, na presença e na ausência de vesículas lipídicas aniónicas, de modo a avaliar a competição daqueles dois tipos de estruturas para a ligação da sonda. Os resultados obtidos mostraram que as vesículas lipídicas aniónicas não eram capazes de induzir a formação extensiva de fibras amilóides por parte do lisozima monomérico. A hipótese de se estabelecer uma interacção forte entre a sonda ThT e as membranas aniónicas que impedisse a sua ligação a estruturas ricas em folhas  foi eliminada através da repetição dos ensaios anteriores com fibras de lisozima pré-formadas. Estes resultados mostram que as variações detectadas, em estudos anteriores, nas propriedades de emissão de fluorescência do Lz-A488 por incubação desta proteína derivatizada com vesículas lipídicas aniónicas serão devidas a alterações na conformação/estado de oligomerização sofridas pelo Lz-A488 sem que ocorra a formação extensiva de agregados com caracteríticas do tipo amilóide.
The ability of anionic lipid membranes to recruit and nucleate amyloid-like assemblies of amyloidogenic proteins/peptides has been a major topic of research. In 2004, Kinnunen and collaborators further extended this concept by proposing that acidic phospholipid-rich membranes could trigger the fibrillation of non-amyloidogenic proteins. Hen egg-white lysozyme is an ideal model non-amyloidogenic protein to investigate this hypothesis as it has been largely used to study the molecular features of protein aggregation in solution. Previous studies have shown that the fluorescence properties of Alexa488 fluorescently-labeled lysozyme (Lz-A488) in interaction with anionic liposomes critically depended on the protein surface coverage of the liposomes. To clarify the photophysical mechanism underlying these results, thermal denaturation profiles of Lz-A488 were monitored at different pHs using fluorescence spectroscopy. The Alexa488 fluorophore was found to be a sensitive reporter for unfolding transitions of lysozyme due to its sensitivity to a photon-induced electron transfer-based quenching mechanism. The impact of lysozyme fibrillation on the fluorescence properties of Lz-A488 was also studied using several Lz-A488/lysozyme mixing ratios (1/2, 1/8, 1/40, 1/100 and 1/200). Lz-A488 always formed mixed fibrils with the corresponding unlabeled protein after prolonged incubation at pH 2.2 and 57 ºC. The characteristic stages of nucleation-polymerization kinetics could be clearly identified by tracking the changes in Lz-A488 fluorescence anisotropy during its fibrillation kinetics (mixtures 1/8 to 1/200). Time-resolved fluorescence anisotropy data showed the occurrence of homotransfer between Lz-A488 molecules incorporated in the mixed mature fibrils produced from the mixture 1/2. However, the mixing ratio used affected the final structure of the mixed fibrils produced, as revealed by their mean fluorescence lifetimes. Finally, competition binding assays of Thioflavin T and lysozyme/ mature lysozyme amyloid fibrils and negatively-charged liposomes were used to show that anionic lipid membranes do not trigger extensive amyloid-like fibril formation of lysozyme at variance with the literature.
Descrição: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012
URI: http://hdl.handle.net/10451/9054
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