Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/9237
Título: Characterization of differentially expressed microRNAs in HIV-1 and HIV-2 infection in human CD4-T cells: a role for miR-34c-5p in T-cell activation and response to HIV infection
Autor: Matos, Ana Margarida Fernandes Pereira de, 1987-
Orientador: Carvalho, Margarida Henriques da Gama, 1972-
Sousa, Ana Espada de, 1962-
Palavras-chave: HIV
MicroRNAs
Linfócitos T
Replicação viral
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: O vírus da imunodeficiência humana (VIH), agente etiológico da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), afecta mais de 34 milhões de pessoas em todo o mundo, estimando-se que existam cerca de 42 mil pessoas infectadas em Portugal. Existem dois vírus responsáveis pelo desenvolvimento de SIDA: o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 e tipo 2 (VIH-1 e VIH-2), que se distinguem principalmente pelo nível de virulência e progressão da doença. O VIH-1 é o mais virulento dos dois vírus e é o responsável pela pandemia observada a nível mundial, enquanto o VIH-2 é endémico em países da África ocidental. Portugal, pelas relações com as suas antigas colónia africanas, é o país da Europa com mais casos de VIH-2, o que proporciona uma oportunidade privilegiada de estudo deste vírus. O VIH pertence à família dos retrovírus de genoma de RNA, necessitando da enzima transcriptase reversa para uma infecção produtiva depois da entrada na célula. Após a integração no genoma do hospedeiro, o vírus usa a maquinaria celular do mesmo para se replicar. A entrada do vírus nas células depende da ligação da cápside viral à molécula de superfície CD4, em associação a um dos co-receptores membranares CCR5 ou CXCR4. Esta dependência implica que os linfócitos T CD4 sejam as células mais infectadas pelo VIH, visto que possuem estas três moléculas de superfície. Após a infecção com o VIH, o sistema imunitário desencadeia uma série de respostas para combater o vírus, entre as quais se destacam a produção de anticorpos e a activação de linfócitos citotóxicos T CD8. No entanto, a resposta imunitária desencadeada não é suficiente para controlar a infecção, o que se reflecte na evolução da doença para uma fase crónica, em que o número de células T CD4 diminui ao longo do tempo. Sendo as células T CD4 as grandes coordenadoras das respostas imunitárias, um decréscimo na população destas células origina uma progressiva fragilidade imunológica do indivíduo. No conjunto da população de células T CD4, o vírus possui competência para infectar células quiescentes, incluindo células naïve e de memória, mas apenas se verifica uma infecção produtiva (com produção maciça de novos viriões) em células T CD4 activadas. Deste modo o vírus tira partido do estado de activação das células T para se replicar, e do estado de quiescência celular das células T CD4 de memória para criar reservatórios virais de células infectadas, que são resistentes aos tratamentos anti-retrovirais que existem actualmente. Um dos conceitos centrais do sistema imunitário é o grande controlo que existe sobre o número e respostas dos linfócitos, de maneira a prevenir doenças linfoproliferativas como cancro ou doenças auto-imunes. A activação dos linfócitos T CD4 naïve é um processo estritamente regulado no que respeita a proliferação, diferenciação e morte celular. Estudos recentes demonstraram que os pequenos RNAs não codificantes têm um importante papel como reguladores destes processos. Dentro do conjunto de pequenos RNAs, os microRNAs são conhecidos como reguladores dos processos de diferenciação celular, crescimento, desenvolvimento, homeostase, resposta ao stress, apoptose e activação imunológica. Além disso, são conhecidos microRNAs com papéis importantes na resposta contra vírus patogénicos, interagindo a múltiplos níveis de forma a modular a replicação viral. Após a entrada do vírus na célula este pode induzir ou inibir a expressão de certos miRNAs, o que potencialmente poderá modular vias de sinalização e respostas ao stress celular. O aumento da expressão de miRNAs específicos contra o vírus poderá originar uma inibição da replicação viral. Por outro lado alguns vírus codificam factores que bloqueiam acções específicas dos miRNAs, enquanto outros codificam microRNAs virais que podem ter influência na célula hospedeira. Em ambos os casos, o vírus está a subverter a defesa celular, resultando numa maior replicação viral. Estudos recentes identificaram um conjunto de miRNAs do hospedeiro cuja expressão aumenta em resposta à infecção por VIH-1, tendo sido demonstrado a sua interacção com mRNAs virais. Por outro lado, foi demonstrada a diminuição da expressão de alguns miRNAs do hospedeiro após a infecção por VIH-1. Embora os mecanismos moleculares responsáveis pela latência do VIH-1 ainda não sejam claros, identificaram-se miRNAs do hospedeiro envolvidos em processos de latência. Estas observações sugerem um papel para os pequenos RNAs não codificantes na modelação da integração, replicação e latência do VIH. Com a sua identificação espera-se clarificar estes mecanismos moleculares e identificar potenciais alvos terapêuticos. Esta dissertação tem como principal objectivo a caracterização de microRNAs que são expressos diferencialmente em resposta à infecção por VIH. Este trabalho integra-se num projecto multidisciplinar com o objectivo de identificar pequenos RNAs com papéis relevantes na modulação da replicação e latência, tanto na infecção por VIH-1 como por VIH-2, em células T CD4 humanas, desenvolvido por um consórcio de investigadores (Prof. Dra Ana E. Sousa, IMM/FMUL; Prof Dra Margarida Gama Carvalho, BioFIG/FCUL; Prof. Dr João Gonçalves, IMM/FFUL). A abordagem inicial utilizada neste projecto envolveu sequenciação massiva de pequenos RNAs de células T CD4 isoladas de dadores saudáveis, na presença e ausência de activação e infecção por VIH-1 e VIH-2. Com base nos resultados de sequenciação, identificámos o miR-34c-5p como um novo candidato na regulação da activação das células T e como um dos microRNAs que é diferencialmente expresso na infecção por VIH. O miR-34c-5p está descrito na literatura como estando incluído numa família de três membros constituída pelo miR-34a, miR-34b e miR-34c, cuja expressão é regulada em parte pelo gene supressor de tumor p53. Esta família está envolvida na regulação de genes com funções anti-proliferativas e pró-apoptóticas, e consequentemente, a sua desregulação está implicada na formação e desenvolvimento de neoplasias. Com o objectivo de confirmar os resultados de sequenciação, validámos nas mesmas amostras, por RT-qPCR, a existência de uma sobre-expressão do miR-34c-5p quando as células T naïve são activadas e uma diminuição da sua expressão quando as mesmas são infectadas por VIH. Verificou-se ainda que a expressão do miR-34c-5p se encontra abaixo dos limites de detecção em células naïve e em células T de memória não-estimuladas, podendo-se considerar este miR como não expresso nestas células. Utilizando o mesmo método, caracterizámos a cinética de expressão do miR-34c-5p durante a activação das células T naïve e de memória. O miR-34c-5p aumenta a sua expressão 48 horas após a activação em células naïve, atingido valores máximos entre as 96 e as 120 horas, ao fim do qual os seus valores voltam a descer. Por outro lado, as células T de memória não apresentam indução do miR-34c-5p após activação. A expressão tardia do miR-34c-5p durante a activação das células T CD4 naïve sugere que este microRNA poderá ter um papel importante no processo de diferenciação ou na limitação da proliferação celular. Com o objectivo de estudar a função deste microRNA e o seu eventual papel durante a infecção de células T, criámos um modelo celular que sobre-expressa constitutivamente o miR-34c-5p por transfecção estável da linha celular Jurkat (linhagem de linfócitos T imortalizada). A análise fenotípica deste modelo celular revela que a sobre-expressão do miR-34c-5p provoca uma diminuição na taxa de proliferação celular, observando-se também uma redução de tamanho nestas células, sugerindo que a expressão deste miR provoca um fenótipo de quiescência celular. Além disso, verificou-se que a expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2 e do co-receptor viral CXCR4 diminui nestas células, identificando-as como alvos directos ou indirectos do miR-34c-5p. Os resultados obtidos neste estudo indicam ainda que a sobre-expressão do miR-34c-5p reduz a eficiência de replicação viral no nosso modelo celular. Os resultados obtidos no âmbito deste trabalho identificam, pela primeira vez, o miR-34c-5p como um microRNA que interage entre a célula T CD4 hospedeira e o VIH, apresentando funções na homeostase das células T e na replicação viral do VIH.
A delicate balance of cell proliferation, differentiation and death occurs upon TCR stimulation A delicate balance of cell proliferation, differentiation and death occurs upon TCR stimulation of naïve CD4 T cells. These processes are likely to involve microRNAs, which target the 3‟UTR of specific mRNAs and represent one of the most important mechanisms of posttranscriptional regulation. Activated CD4 T cells are the main targets of HIV infection, which critically depends of the state of cellular activation for effective integration and productive viral replication. We hypothesized that HIV may subvert the microRNA profile induced by TCR stimulation. Based on a massive parallel sequencing study of the total microRnome of human naïve CD4 T cells upon cell activation and HIV infection, we identified miR-34c-5p as a novel candidate in the regulation of T cell activation. Moreover, we found this miR down-regulated during HIV infection. Independent RT-qPCR validation of miR-34c-5p expression levels in CD4 T cells confirmed its up-regulation after TCR stimulation, and down-regulation following HIV infection of activated CD4 T cells. Expression kinetic studies revealed that miR-34c-5p levels, measured by RT-qPCR, started to increase later upon activation, suggesting a role in cell survival/apoptosis. Additionally, our in silico analysis predicted miR-34c-5p to regulate several target genes that are relevant for T cell function and HIV infection. In order to further elucidate this, stable Jurkat T cell lines constitutively over-expressing miR-34c-5p were generated. In addition to changes in cell size and proliferation, miR-34c-5p over-expression resulted in the down-regulation of Bcl-2 and CXCR4, with potential implications for HIV replication and latency. Moreover, over-expression of miR-34c-5p was found to inhibit viral replication in stable Jurkat clones, suggesting an important role for this miR in the process of HIV infection. of naïve CD4 T cells. These processes are likely to involve microRNAs, which target the 3‟UTR of specific mRNAs and represent one of the most important mechanisms of posttranscriptional regulation. Activated CD4 T cells are the main targets of HIV infection, which critically depends of the state of cellular activation for effective integration and productive viral replication. We hypothesized that HIV may subvert the microRNA profile induced by TCR stimulation. Based on a massive parallel sequencing study of the total microRnome of human naïve CD4 T cells upon cell activation and HIV infection, we identified miR-34c-5p as a novel candidate in the regulation of T cell activation. Moreover, we found this miR down-regulated during HIV infection. Independent RT-qPCR validation of miR-34c-5p expression levels in CD4 T cells confirmed its up-regulation after TCR stimulation, and down-regulation following HIV infection of activated CD4 T cells. Expression kinetic studies revealed that miR-34c-5p levels, measured by RT-qPCR, started to increase later upon activation, suggesting a role in cell survival/apoptosis. Additionally, our in silico analysis predicted miR-34c-5p to regulate several target genes that are relevant for T cell function and HIV infection. In order to further elucidate this, stable Jurkat T cell lines constitutively over-expressing miR-34c-5p were generated. In addition to changes in cell size and proliferation, miR-34c-5p over-expression resulted in the down-regulation of Bcl-2 and CXCR4, with potential implications for HIV replication and latency. Moreover, over-expression of miR-34c-5p was found to inhibit viral replication in stable Jurkat clones, suggesting an important role for this miR in the process of HIV infection.
Descrição: Tese de mestrado, Doenças Infecciosas Emergentes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/9237
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