Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/9526
Título: Targeting phosphodiesterase-4 in cancer
Autor: Varela, Ana Maria de Sousa
Orientador: Lin, De-Chen
Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Palavras-chave: Biologia molecular
Migração celular
Proliferação de células
Apoptose
Cancro
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Adenosina monofosfato cíclico (cAMP) é um mensageiro secundário que se tem conservado ao longo da evolução, desempenhando papéis fundamentais na sinalização celular e transcrição de genes. O cAMP é gerado a partir de ATP através da acção de adenilil ciclases, que se localizam na superfície citosólica da membrana plasmática e respondem a estímulos de receptores transmembranares acoplados a proteínas G. Após formado, cAMP interage com proteínas efetoras desencadeando respostas celulares a diversos níveis, tais como metabolismo, expressão génica e proliferação e ciclo celulares. Dada a sua grande importância para a célula, os seus níveis são altamente controlados de modo a manter um equilíbrio entre a sua produção e degradação. Actualmente sabe-se que as concentrações de cAMP são compartimentalizadas e extremamente variáveis, podendo oscilar desde alguns minutos a várias horas. A criação destes gradientes de cAMP mostra o quão complexos e fundamentais são estes sinais na regulação celular. A estrutura dos gradientes é em parte dependente da restrita localização e actividade das proteínas G e adenilil ciclases. A activação específica de certas adenilil ciclases permite a formação de “nuvens” de cAMP que vão variando em concentração ao longo da membrana plasmática. Também a acção de determinadas proteínas organizadas em sub-populações dentro da célula contribui para o efeito de compartimentalização. Outro factor muito importante é a acção de fosfodiesterases (PDEs), proteínas responsáveis pela degradação de cAMP. Estas têm uma localização muito abrangente, podendo ser encontradas no citosol, membrana plasmática, núcleo ou citoesqueleto celular, o que também contribui para a modulação espacial e temporal dos gradientes de cAMP. Fosfodiesterases foram primeiramente descritas por Sutherland et al., (1962) pouco depois da descoberta da adenosina monofosfato cíclico. São fosfohidrolases que catalisam de um modo selectivo a hidrólise das ligações 3’ de fosfato cíclico de adenosina e/ou guanosina 3’,5’ monofosfato cíclico. A classe PDE compreende cerca de vinte e um genes e é subdividida em onze famílias (PDE1-PDE11) que partilham 35% a 50% de similaridade entre sequências. Estas podem ainda ser divididas em sub-famílias que abrangem proteínas com diversas isoformas. Fosfodiesterase-4 (PDE4) é um membro da super família PDE. Tendo sido uma das primeiras famílias PDE a ser descoberta, é também uma das mais bem estudadas ao nível bioquímico, genético e fisiológico. Esta família compreende quatro genes, PDE4A/B/C/D, que codificam para mais de vinte isoformas proteicas. A conservação entre espécies destas proteínas e a existência de variadas isoformas com a mesma função catalítica implica que cada uma delas seja funcionalmente importante e sugere que as sequências génicas tenham sido sujeitas a grandes pressões selectivas ao longo da sua evolução, de forma a protegê-las de eventos divergentes ou mutacionais. A produção das isoformas proteicas é controlada pela acção de promotores distintos e splicing de RNA mensageiro. As isoformas PDE4 possuem uma estrutura modular que consiste de uma região N-terminal característica de cada uma, um domínio catalítico altamente conservado e de uma região C-terminal específico de cada sub-família. Podem ainda ser divididas em três categorias dependendo da sua estrutura: i) long-forms que têm dois módulos UCR1 e UCR2 posicionados entre a região N-terminal e a unidade catalítica, ii) short-forms que apenas possuem um módulo UCR2, iii) e super short-form que para além de não terem UCR1, o módulo UCR2 também se encontra truncado. Os módulos UCR1 e UCR2 estão interligados por regiões de ligação LR1 e LR2 e são de grande importância para a regulação destes genes pois funcionam como um domínio regulatório que controla a unidade catalítica e mecanismos de regulação por fosforilação. Especificamente, estes dois módulos parecem interagir entre si para alterar a conformação da unidade catalítica e mediar a fosforilação por parte de outras proteínas, nomeadamente PKA e ERK. Após o aumento intracelular de cAMP, PKA fosforila PDE4 levando à degradação de cAMP. A proteína ERK também fosforila PDE4, à excepção da subfamília PDE4A, o que inactiva as long-forms e activa as short-forms. Existem também outras formas de regulação, como a via CRE/CRE-binding protein e outras proteínas como arrestinas e proteínas ancoradoras de quinase-A. PDE4s estão associadas a diversas doenças incluindo a asma, esquizofrenia e cancro. Vários compostos com capacidade para inibir os genes PDE4 têm vindo a ser desenvolvidos ao longo dos anos, contudo, embora alguns tenham mostrado ser bastante eficientes, os efeitos secundários adversos causados nos pacientes levaram a que as pesquisas fossem descontinuadas. Uma principal razão para o insucesso destes compostos é o facto de não serem específicos para cada isoforma de PDE, inibindo várias delas ou mesmo várias das famílias em muitos dos tecidos corporais, o que traz consigo muitos efeitos indesejados. Recentemente foi desenvolvido um novo grupo de moléculas, 7H-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazines, que foram apresentadas como tendo potências inibitórias específicas para a família PDE4 na escala dos nanomolar. Estas moléculas ligam-se de maneira a bloquearem o domínio catalítico da fosfodiesterase-4, o que impede a aproximação de cAMP e a sua degradação. A relação próxima entre cAMP e proliferação celular e o seu envolvimento no desenvolvimento de células malignas têm sido das principais motivações no desenvolvimento de inibidores de fosfodiesterases-4, que uma vez inactivas levam ao aumento dos níveis de cAMP e à desregulação celular. Em estudos com leucemina linfocítica crónica, a inibição de PDE4 com rolipram aumentou os níveis de cAMP induzindo apoptose das células dependendo do tempo e da dose (Kim and Lerner 1998). Em 2002, Chen e colegas sugeriram em estudos com células de glioma que após tratamento com rolipram, a proliferação celular foi cessada e a diferenciação estimulada, seguida de morte por apoptose (Chen, Wadsten et al. 2002). Também foi demonstrado que a inibição de PDE4 em células de leucemia linfoblástica causa abrandamento do ciclo celular e morte por apoptose (Ogawa, Streiff et al. 2002), e que a combinação da administração de drogas para inibir a família PDE4 com outros tipos de terapia, como radiação e quimioterapia, pode ter efeitos sinergéticos com melhores resultados (Goldhoff, Warrington et al. 2008). Recentemente o nosso grupo publicou um estudo onde microdeleções homozigóticas foram identificadas no locus do gene humano PDE4D, tanto em tumores primários como em várias linhas celulares de diferentes origens cancerígenas. Contudo, tais deleções não resultaram em inactivação do gene, pelo contrário, os níveis de expressão destas proteínas foi elevada em vários dos cancros analisados, contribuindo para a proliferação e sobrevivência das células tumorais (Lin, Xu et al. 2013). Desta forma, no presente estudo decidimos estudar o impacto de dois outros genes da mesma família, PDE4A e PDE4B, em diversas linhas celulares tumorais, nomeadamente de melanoma maligno, carcinoma gástrico e adenocarcinoma da mama e do endométrio. De modo a estudar o impacto dos genes PDE4A e PDE4B na proliferação e sobrevivência celular, silenciámos ambos os genes através da infecção das células com partículas lentivirais a expressar shRNAs que têm como alvo todas as suas isoformas proteicas. Todas as linhas celulares, à excepção da MB-231 (cancro da mama), mostraram retardamento no crescimento e morte por apoptose após o silenciamento de pelo menos um dos genes. Por outro lado, ao expressar ectopicamente o gene PDE4B2 em células de melanoma e cancro gástrico, a proliferação celular resultou em aceleramento relativamente aos controlos, tanto in vitro como in vivo, evidenciando a contribuição destes genes para aumentar as características neoplásicas em linhas celulares cancerígenas, e como consequência a tumorigenicidade. De forma a confirmar os resultados obtidos, silenciámos o gene PDE4B em células estáveis a expressar ectopicamente a isoforma PDE4B2, e observámos que a expressão deste último é capaz de prevenir as células de sofrerem morte celular após o silenciamento de PDE4B. Por fim testámos um grupo de moléculas descritas como tendo capacidades inibitórias específicas para os genes PDE4 (7H-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazines) em variadas linhas celulares de diferentes cancros. Os resultados mostraram ser promissores, uma vez que foi observado uma redução dramática na proliferação celular com morte por apoptose após tratamento com doses crescentes. Também o aumento de cAMP intracelular foi confirmado, acompanhado de um acréscimo na quantidade de proteínas associadas ao controlo do ciclo celular e redução de proteínas associadas ao aceleramento do mesmo. Para concluir, este estudo vem sugerir que a inibição do gene PDE4 é uma potencial terapia no tratamento do cancro.
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is an evolutionarily conserved secondary messenger, which is important for cell signaling regulation and gene transcription. Thus, a certain balance of cAMP levels inside the cells is required. Phosphodiesterase 4 (PDE4) genes are master regulators of both spatial and temporal cAMP levels, being essential for cAMP degradation. If PDE4 genes are not functioning properly, cAMP levels will rise up causing instability inside the cell and probably inducing cell growth arrest or apoptosis in human cancer cells. In fact, PDE4D was previously shown to have high expression levels in multiple cancers, thus contributing to proliferation and survival of tumor cells, which suggests that this gene may be a potential therapeutic target. In the present study we explored other two PDE4 members, namely PDE4A and PDE4B. We manipulated gene expression of these cells in a panel of different human cancer cell lines and our data suggests that these two genes are of great importance to cancer cells, without which cells cannot proliferate and survive. We also showed both in melanoma and gastric cancer that ectopic expression of PDE4B contributes to a better and faster proliferation of the cell lines and, for the specific case of melanoma, higher levels of PDE4B may be related to a higher capability of cell migration. We also tested a set of novel small molecules reported to be selective inhibitors of PDE4 with nanomolar potencies. Our data suggests that this new compound possess anti-neoplastic capabilities against a wide panel of different human cancer cell lines, both in vitro and in vivo.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/9526
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