Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/9652
Título: Dissecting the pluripotent state of embryonic stem cells
Autor: Silva, Willianne Kaline Alves da, 1985-
Orientador: Henrique, Domingos, 1960-
Rodrigues, Maria Gabriela, 1965-
Palavras-chave: Células estaminais embrionárias
Marcadores celulares
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Embryonic Stem Cells(ESC) are undifferentiated cells derived from the blastocyst and are able to self-renew indefinitely in defined minimal conditions, in the presence of LIF, BMP4 and MEK/GSK3 inhibitors. Pluripotency is an ESC property regulated by a complex gene regulatory network (GRN) that have, at its core, the pluripotency genes Nanog, Oct4 and Sox2. While OCT4 and SOX2 are homogenously expressed in ESCs, NANOG expression fluctuates between states of high NANOG and low NANOG expression. In this way, NANOG is considered a master transcriptional regulator of self-renewal and pluripotency in ES cells, regulating the propensity of ESCs to differentiate. One question poorly understood is how this heterogeneity define a functional subpopulation. To address this question, one needs to be able to purify specific subpopulation of ESCs using cell surface markers. Starting with a mouse ESC line (Nd) containing a fluorescent Nanog:VNP reporter, we tested the ability of various surface markers to sort sub-populations of ESCs, in combination with Nanog:VNP, after culture in different cell culture media (GMEM/LIF, 2i/Lif and BMP4/LIF), using FACS analysis. Ten different antibodies, known to label different functional subpopulations of pluripotent cells, were tested, together with the Nanog:VNP marker. We were able to identify 6 antibodies that, together with the Nanog:VNP reporter, can label specific subsets of ESCs: Pecam, Ephb4, SSEA1 and CD81 as ESC markers, CD40 as Trophoblast stem cell marker, and Notch3 as Epiblast marker. This work shall allow the characterization of various transition states in cultures of ESCs and is a first step in studying the functional heterogeneity of ESCs.
Durante o desenvolvimento embrionário, o zigoto passa por um processo de clivagem produzindo blastômeros que se organizam para formar uma massa compacta chamada mórula e blastocisto. Este é estruturalmente composto por um espaço chamado cavidade blastocística (ICM) e por uma camada de células externas chamada trofoblasto (TE). À medida que o zigoto se vai dividindo, as células restringem o seu potencial de desenvolvimento pela especificação de linhagem e segregação espacial. O evento prioritário que contribui para o desenvolvimento do zigoto em mamíferos consiste na especificação de tecidos extra e intra-embrionários para a preparação para a implantação. Com a implantação do blastocisto, uma segunda mudança ocorre nas células da cavidade blastocística que vão originar o Epiblasto e o Endoderma primitivo. As células estaminais são células indiferenciadas que têm a habilidade de autorenovação ilimitada e diferenciação em diversas linhagens multicelulares, podendo ser encontradas em diferentes tecidos. Um tipo particular de células estaminais, são as células estaminais embrionárias que tem origem a partir da cavidade blastocística e que, quando mantidas “in vitro” sob condições de cultura específicas, têm a capacidade de manter a sua “estaminalidade”. Esta propriedade das células estaminais embrionárias é mantida por uma rede genética complexa, cujo núcleo central pode ser reduzido a três genes que codificam os fatores de transcrição: NANOG, OCT4 e SOX2. Diversos estudos têm sido desenvolvidos para controlar este balanço entre os vários sinais moleculares associados à pluripotência responsáveis pela ativação ou repressão de genes que culminam num destino para a célula. No entanto, os mecanismos que regulam a maneira como estas células escolhem o seu destino ou a maneira como entram para a diferenciação continuam sem ser desvendados. Diferentes estudos, descrevem moléculas associadas a diferentes vias de sinalização que pode mimetizar um ambiente in vivo. O LIF é um exemplo deste tipo de moléculas uma vez que, através da via JACK- STAT3, BMP e inibidores de GSK3,são capazes de manter a pluripotências das células estaminais. Logo, o desafio consiste na compreensão da interação concertada destes fatores de transcrição que regulam a pluripotência e as vias de sinalização a fim de analisar e manipular a interação entre os sinais. O NANOG distingue-se do OCT4 e SOX2 pelo nível de expressão heterogênea em células estaminais que flutua entre uma expressão LOW NANOG e uma expressão HIGH NANOG. Para além disso, estudos sugerem que a expressão heterogênea do NANOG, observada tanto in vitro como in vivo, deve influenciar a sua recetividade aos diferentes estímulos de diferenciação sendo, por isso,considerado o modulador central da pluripotência. Dado que a flutuação da expressão do NANOG tem um papel importante na escolha de um destino para a célula e que estes níveis podem estar associados a sub-populações de células estaminais, torna-se necessário identificar estas subpopulações. Para atingir este objetivo, neste estudo foram utilizados diversos marcadores específicos de superfície celular descritos por Rungg-Gunn e colaboradores para identificar, isolar e caracterizar células estaminais. Neste trabalho foi utilizada uma linha celular que contem um repórter fluorescente de NANOG (linha celular Nd), previamente estabelecida e validada no laboratório e uma linha celular usada como controlo: E14tga2. Estas linhas celulares foram mantidas através de passagens em diferentes condições de culturas: GMEM/LIF, BMP4/LIF e 2i/LIFem condições de pluripotência. Para analisar a capacidade destas células em se diferenciar, foram mantidas, apenas, em GEMEM. Estas linhas foram validadas em termos de capacidade de auto-renovação e pluripotência tendo-se observado que as suas características não diferiam daquelas da linha celular controlo. Adicionalmente, a expressão do NANOG:VNP foi monitorizada por FACS para avaliar a capacidade destas células para entrar em diferenciação, sugerindo que o estado das células estava em concordância com o meio de cultura utilizado. Neste trabalho, foram também utilizados 10 anticorpos descritos para células estaminais embrionárias, epiblasto ou células do trofoblasto em diferentes meios de cultura. Destes, em seis obteve-se êxito para caracterizar subpopulações de células estaminais. Para marcar ESC foram utilizados Pecam, EphB4, SSEA1 e CD81; para marcar células do trofoblasto foi utilizado CD40 e para marcar Epiblasto foi utilizado Notch3. As células foram analisadas pela expressão de cada marcador específico de superfície por FACS e, em seguida, utilizando a linha celular Nd repórter expressando o NANOG, foram separadas em quatro supopulações associadas com cada marcador específico de superfície: VNP+, Single+, Double + e Double negative em cada condição. Os resultados obtidos mostram que alguns dos marcadores usados foram mais específicos para identificar a subpopulação Low NANOG que é um estado transitório para a diferenciação. Entre os anticorpos que foram descritos, os mais promissores para identificar diferentes linhagens de células estaminais foram o Pecam (ESC), CD40 (células do trofoblasto) e Notch3 (Epiblasto). Estas observações sugerem que o comportamento dinâmico do repórter NANOG:VNP associado com marcadores específicos para linhagens possibilita investigar a regulação da pluripotência e identificar os estágios transientes que co-existem numa população de células estaminais.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/9652
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