Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/9655
Título: The role of Mesogenin1 in the dynamics of movement and differentiation of mesoderm progenitor cells
Autor: Figueira, Ana Margarida da Silva, 1990-
Orientador: Saúde, Leonor
Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-
Palavras-chave: Peixe-zebra
Embriologia animal
Hibridação in situ
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Gastrulation in zebrafish involves four cell movements: epiboly, involution, convergence and extension. These cell movements are required to move the mesoderm progenitor cells (MPCs) located at the lateral region of the germ ring to the anterior segmental plate so that they can give rise to trunk somites. The tailbud, which is formed at the end of gastrulation, contains the MPCs that will give rise to tail somites and therefore, at this location, their movements into the posterior presomitic mesoderm (PSM) also need to be tightly controlled. Work from our lab has shown that the transcription factor Mesogenin1 (Msgn1) regulates cell movements in the tailbud. Since msgn1 is expressed not only in the tailbud during somitogenesis, but also in the germ ring, it could also control cell movements during gastrulation. To analyze the role of Msgn1 on cell movements, a cell co-transplantation technique was performed using wild-type cells and mutant or transgenic cells from a msgn1-/- line or a hsp70:HA-msgn1 line that allows time-specific over-expression of msgn1, respectively. The results suggest that Msgn1 is involved in the regulation of convergence and extension movements during gastrulation and confirm that it is also involved in governing the flux of cells from the tailbud into the PSM. Finally, to determine if msgn1 induces differentiation of MPCs, and based on a microarray experiment previously performed in our lab, the expression patterns of two target genes that are important for paraxial mesoderm production were analyzed: crabp2b and ripply1. The results indicate that Msgn1 induces their expression, suggesting that it also contributes to switch-on the PSM character. Thus, Mesogenin1 plays a key role during development, coupling MPCs movements during gastrulation and tail extension with the acquisition of a PSM fate.
A gastrulação é um processo morfogenético onde migrações e rearranjos celulares estabelecem os três folhetos germinativos: endoderme, mesoderme e ectoderme [1-3]. Apesar dos padrões de gastrulação variarem no reino animal, existem quatro tipos de movimentos celulares evolutivamente conservados: epibolia, involução, convergência e extensão. No peixe-zebra, a epibolia termina quando o vitelo fica completamente coberto pela blastoderme. A involução começa aos 50% de epibolia e, nesta fase, as células ao longo da margem da blastoderme começam a internalizar, formando o anel germinativo. As células desta região começam depois a convergir para a zona dorsal, formando um espessamento local designado por escudo embrionário. Por fim, os movimentos de convergência e extensão (CE) contribuem conjuntamente para o encurtamento medio-lateral dos folhetos germinativos e para a extensão do embrião ao longo do eixo antero-posterior [3-5]. Ao longo do eixo dorso-ventral do anel germinativo são observados diferentes graus de extensão e convergência. No domínio lateral do anel germinativo, os movimentos de CE são inicialmente lentos e aceleram à medida que as células se aproximam da linha dorsal, sendo que estas irão contribuir mais tarde para os sómitos do tronco (1 a 15) [6-8]. Na região mais ventral do anel germinativo, as células não participam nos movimentos de CE, apenas migram na direcção do polo vegetal onde contribuem para a formação do botão caudal, e mais tarde para os sómitos caudais (16 a 30) [7-9]. No final da gastrulação, o plano corporal básico do organismo está estabelecido e inicia-se o período de segmentação, durante o qual se formam os sómitos [10]. À medida que os sómitos se vão formando a partir da região anterior da mesoderme pré-somítica (MPS), as células progenitoras da mesoderme (CPM) que se encontram no botão caudal vão fornecendo novas células para a zona posterior da MPS [8]. O número de CPM e a taxa a que se diferenciam e se movem para a MPS têm de ser controlados de modo a que se forme o número correcto de sómitos. Para que as CPM possam progredir para a MPS é necessário reduzir os níveis de expressão de marcadores de células progenitoras, como ntl e wnt8. Alguns estudos sugerem que o factor de transcrição Mesogenin1 (Msgn1) pode estar envolvido na terminação do loop auto-regulatório de ntl e wnt [11, 12]. No peixe-zebra a msgn1 é expressa no botão caudal durante a segmentação e Fior et al. verificaram que nos mutantes nulos de msgn1 ocorre uma acumulação de CPM no botão caudal e que os movimentos celulares na transição para a MPS ficam comprometidos [12-14]. Alguns dos comportamentos e movimentos celulares que ocorrem durante a extensão do botão caudal são semelhantes a movimentos observados durante a gastrulação e, portanto, tem sido sugerido que os movimentos no botão caudal podem ser uma continuação da gastrulação [15-17]. No peixe-zebra, a Mesogenin1 também é expressa na zona marginal da blastoderme durante a gastrulação, excluindo a região do escudo embrionário [13, 14], no entanto a sua função durante este estádio é ainda desconhecida. Este trabalho pretende avaliar o papel da Mesogenin1 na produção da mesoderme paraxial, nomeadamente o seu envolvimento nos movimentos celulares que decorrem nos períodos de gastrulação e de segmentação, mas também na diferenciação das CPM. Na primeira parte deste estudo, recorreu-se à técnica de co-transplante de células com níveis normais de msgn1 (controlo) e de células mutantes ou que sobre-expressam msgn1, com recurso a uma linha mutante (msgn1-/-) e uma linha transgénica (hsp70:HA-msgn1) que permite sobre-expressar a msgn1 num tempo específico, através de um choque térmico. A primeira experiência de transplantes teve como objectivo verificar o efeito da Msgn1 na contribuição das CPM para os sómitos do tronco. Quando células controlo e células mutantes, marcadas com diferentes corantes celulares, foram transplantadas para a região lateral da margem de um embrião receptor, as células mutantes contribuíram em maior frequência para sómitos mais posteriores do tronco. Na mesma experiência mas comparando células controlo e células transgénicas (com um choque-térmico aos 30% epibolia), as células transgénicas contribuíram apenas para os sómitos mais anteriores do tronco e em maior frequência. Isto sugere que a Msgn1 afecta os movimentos de CE durante a gastrulação. A hibridação in situ dupla com recurso a marcadores vastamente usados em estudos de CE (hgg1, dlx3 e ntl) confirmou que na ausência de Msgn1 estes movimentos ficam comprometidos, e que o excesso de Msgn1 os promove. Numa segunda experiência avaliou-se os efeitos da Msgn1 na contribuição das CPM para os sómitos caudais. Quando células controlo e células mutantes, marcadas com diferentes corantes celulares, foram co-transplantadas para a região ventral da margem de um embrião receptor, as células mutantes contribuíram em maior frequência para sómitos mais posteriores que as controlo, e não contribuíram para os primeiros sómitos que as células controlo contribuíram. Por outro lado, na mesma experiência comparando células controlo e células transgénicas, as células transgénicas contribuíram em maior frequência para os sómitos mais anteriores da cauda e nunca para últimos sómitos do embrião. Estes resultados vão de encontro ao descrito no trabalho de Fior et al., onde observaram que as células mutantes demoram mais tempo a sair do botão caudal, o que explica o facto de elas contribuírem em maior frequência para sómitos mais posteriores e de não contribuirem para os primeiros que as células controlo contribuem [12]. Do mesmo modo, células que sobre-expressam msgn1 saem do botão caudal mais rápido, esgotando-se precocemente, explicando o facto destas células se encontrarem em maior frequência em sómitos mais anteriores e de não contribuírem para os sómitos mais posteriores da cauda. Na segunda parte deste trabalho, pretendeu-se perceber se a Msgn1 também estaria envolvida na indução da diferenciação da mesoderme paraxial. Fior et al. mostraram que a Msgn1 desliga genes importantes para a manutenção do estado progenitor, como ntl, wnt3a, wnt8 e fgf8 [12]. Um estudo de microarrays realizado no nosso laboratório revelou que a Msgn1 também regula genes importantes para a produção de mesoderme paraxial, como o crabp2b e o ripply1. O Crabp2b regula o acesso do ácido retinóico aos seus receptores nucleares, ajudando a modular o seu gradiente que por sua vez é muito importante na somitogénese [18-20]. O Ripply1 é importante na terminação do programa de segmentação na PSM e para manter a polaridade rostro-caudal dos sómitos [21]. Através de hibridações in situ verificou-se que de facto a Msgn1 induz a expressão de ambos os genes, sugerindo que também está envolvida na regulação da diferenciação das CPM. Outro dado que aponta para a importância da Msgn1 na produção de mesoderme paraxial é o facto dos embriões hsp70:HA-msgn1 apresentarem falhas na notocorda quando a msgn1 é sobre-expressa [12]. É possível que a expressão de msgn1 em células destinadas a formar notocorda faça com que se inicie o programa de diferenciação da MPS e que essas células se tornem somíticas. Para testar esta ideia, células transgénicas da região da notocorda podem ser transplantadas para a mesma região de um embrião receptor, e mais tarde avaliada a sua capacidade de se diferenciarem em sómitos. Neste trabalho testou-se três abordagens para responder a esta questão: transplante heterocrónico de células no estadio de blástula, transplante isocrónico/homotópico de células do escudo embrionário (região que originará posteriormente a notocorda) e transplante homotópico do escudo embrionário inteiro, no entanto os resultados não foram conclusivos. Em suma, este trabalho contribui para uma melhor compreensão do papel da Msgn1 no desenvolvimento do peixe-zebra, revelando a sua importância para a produção da mesoderme paraxial, através da sua intervenção no controlo dos movimentos das CPM, tanto na gastrulação como na segmentação, e na sua diferenciação.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/9655
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