Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/9681
Título: Análise molecular da região NS3 do vírus da hepatite C e estudo da resistência aos novos antivirais no contexto da implementação de novas estratégias para tratamento da infecção crónica
Autor: Silva, Tânia Sofia Santos, 1989-
Orientador: Pádua, Elizabeth
Crespo, Ana Maria Viegas, 1946-
Palavras-chave: Hepatite C
Resistência aos antivirais
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Num futuro próximo, os dois inibidores da protease (IP) aprovados pela FDA - Telaprevir e Boceprevir - serão administrados no tratamento dos doentes crónicos infectados por VHC, e este facto tem implicações clínicas para a adequação dos regimes terapêuticos. Assim, torna-se crucial, desenvolver uma metodologia para conhecer as melhores estratégias laboratoriais e clínicas a seguir, na monitorização e tratamento da infecção por VHC. O presente estudo pretendeu desenvolver um método in house de amplificação e sequenciação da região NS3 que permitisse, por um lado, a classificação do VHC, e por outro lado a identificação e monitorização de mutações de resistência aos IP numa população de conveniência de UDI, infectada por VIH e drug-naive aos IP. Amostras de 47 indivíduos foram submetidas ao rastreio de anticorpos anti-VHC e os casos positivos selecionados para a amplificação e sequenciação das regiões 5’UTR (ensaio comercial) e NS3 (ensaio in house) do VHC. Algumas amostras e respectivos produtos de PCR foram selecionados para procedimentos de clonagem do fragmento NS3. A classificação do VHC foi realizada por estimativa filogenética para as duas regiões genómicas do VHC. Na população estudada foi obtida uma prevalência de 93,6% para anticorpos anti-VHC e 70,5% de infecção activa por VHC. A estimativa filogenética (e em alguns casos a análise de bootscanning) para a região NS3, revelou uma maior prevalência de casos classificados de subtipo 1a (46,2%), seguida de uma igual proporção de casos de subtipos 3a, 4a e 4d (15,4%). Foram ainda classificados 2 casos de potenciais formas recombinantes: RF_1b/2k (3,8%) e 2q/2k (3,8%). Nas sequências consenso analisadas, as mutações V36L (elevada prevalência), T54A, I72T e Q80K (baixa prevalência), que conferem grau baixo e médio de resistência aos IP, foram identificadas em 57,6% dos indivíduos estudados. Em sequências derivadas da mesma amostra foi observada também uma variação intra-indivíduo devido à presença de quasispecies nas amostras analisadas. O ensaio de genotipagem (região 5’UTR) comercial revelou limitações para a diferenciação dos subtipos 1a e 1b, bem como para classificação dos subtipos 4c e 4d. Contrariamente, a região NS3 mostrou ter vantagem na subtipagem do VHC. Estudos de maior amostragem são necessários para avaliar a influência do genótipo ou do subtipo de VHC na emergência de variantes naturais de resistência aos IP, e também, para conhecer o verdadeiro impacto das mutações na eficácia da terapia antiviral no tratamento dos doentes crónicos.
In a near future, two protease inhibitors (PI) approved by FDA - Telaprevir and Boceprevir, will be administered in the treatment of HCV chronically infected patients, and it has clinical implications in the adjustment of treatment regimens. Thus, it becomes crucial to develop a methodology to determine the best clinical and laboratory strategies to follow in monitoring and treatment of HCV infection. The present study aimed to develop an in house method for amplification and sequencing of the HCV NS3 region that allowed both HCV classification and identification and monitoring of PI resistance mutations in a convenience population of IDU, HIV-infected and drug-naive to PI. Samples from 47 patients were subjected to screening of anti_HCV antibodies and the positive cases have being selected for the amplification and sequencing of the 5 'UTR region (commercial assay) and the NS3 region (in house assay). Some samples and their respective PCR products were selected for cloning of NS3 fragment. The HCV classification was estimated by phylogenetic analysis for the two HCV genomic regions. In the study population was obtained a prevalence of 93.6% for anti-HCV antibodies and 70.5% of HCV active infection. Phylogenetic analysis (and in some cases bootscanning analysis) for NS3 region, showed a greater prevalence of patients classified as subtype 1a (46.2%), followed by an equal proportion of subtypes 3a, 4a and 4d (15.4%). There was also 2 patients classified as potential recombinant forms: RF_1b/2k (3.8%) and 2q/2k (3.8%). In the analyzed consensus sequences, mutations V36L (high prevalence), T54A, and I72T Q80K (low prevalence), which provide low to medium degree of PI resistance were identified in 57.6% of patients. It was also observed in sequences derived from the same sample, intra-individual variation due to the presence of quasispecies. The genotyping commercial assay (5'UTR region) showed limitations in subtypes 1a and 1b differentiation, as well as in subtypes 4c and 4d classification. In contrast, NS3 region showed to have advantage in HCV subtyping. Larger samples studies are needed to evaluate the influence of HCV genotype or subtype in the emergence of natural PI resistance variants, and also to know the true impact of mutations in the efficacy of antiviral therapy in chronic patients treatment.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/9681
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