Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/9819
Título: In vitro assessment of the oncogenic potential of novel MTC-associated germline RET mutations
Autor: Carmo, Maria Francisca Ferreira, 1989-
Orientador: Rodrigues, Maria Gabriela, 1965-
Silva, Ana Luísa Brás dos Santos Ribeiro da, 1984-
Palavras-chave: Carcinoma
Tiróide
Mutações genéticas
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Thyroid carcinoma is the most frequent endocrine malignancy. Medullary thyroid carcinoma (MTC) is one of the thyroid tumors and represents about 5 to 8% of all cases. It arises from C cells (parafollicular cells), in contrast with the other thyroid tumors that arise from follicular cells. MTC can occur either in a sporadic or hereditary form, being the latter associated to multiple endocrine neoplastic type 2 (MEN2) and familial MTC (FMTC). RET (rearrangement during transfection) encodes a membrane receptor tyrosine kinase that, when mutated, can originate MTC. The aim of this project was to evaluate, through in vitro functional experimental approaches, the oncogenic potential of two newly identified RET germinal variants detected in two MTC patients from our institution: RET C515T (RET missense alteration TGCTGG at codon 515 - Cys515Trp) and RET T636M (RET missense alteration ACGATG at codon 636 - Thr636Met. By expressing the novel RET variants in non-transformed NIH 3T3 mouse fibroblasts, and comparing their effect with wild-type RET, we were able to observe an increase of cell growth and proliferation, loss of contact inhibition and an increase in cell migration rate. All these are common characteristics of tumoral cells, indicating that these new RET variants hold some relevant transforming potential. This transforming potential is, nevertheless, low when compared to that of RET MEN2A- causing mutation, C634R, which is consistent with the mild phenotype, observed in the patients of this study, characterized by late onset and low aggressiveness. The functional characterization of these two new variants not only contributes to the understanding of the molecular mechanisms behind the development of MTC in these families, but also provides useful information to optimize the diagnostic and clinical management of hereditary MTC.
Após um quarto de século de grandes avanços, a investigação na área da oncologia tornou-se rica e complexa, mostrando assim que o cancro é uma doença que envolve mudanças dinâmicas no genoma. Muitas evidências indicam que a tumorigénese em humanos é um processo com várias etapas, que reflete não só as alterações no genoma, mas também que levam a uma transformação progressiva de células normais em células derivadas altamente malignas. Carcinoma é qualquer tumor maligno que provenha de células epiteliais, e que pode originar metástases. Existem inúmeros tipos de carcinoma, sendo os carcinomas endócrinos um deles, abrangendo uma enorme variedade, tanto a nível do fenótipo como do genótipo. Os carcinomas da tiróide são o tipo de carcinomas endócrinos mais frequentes, e podem ser divididos em dois grandes grupos: os carcinomas da tiróide que provêm de células foliculares e os carcinomas da tiróide que provêm de células parafoliculares. Os carcinomas medulares da tiróide (CMT) representam cerca de 5 a 8% dos carcinomas da tiróide. Estes desenvolvem-se a partir de células C (células parafoliculares), enquanto os outros tipos de tumores desenvolvem-se a partir das células foliculares. Os carcinomas medulares podem ocorrer de forma esporádica (cerca de 75% do total dos casos) ou hereditária (cerca de 25%), sendo esta última associada a síndrome de neoplasia endócrina múltipla de tipo 2 (NEM2), subdividida em NEM2A e NEM2B, e CMT familiar (CMTF). Os carcinomas medulares da tiróide possuem uma enorme variedade, que podem ir de tumores com bom prognóstico, a carcinomas altamentes agressivos, com uma elevada taxa de mortalidade. Mutações no proto oncogene RET (Rearranjado durante a transfeção) estão na origem do desenvolvimento do carcinoma medular da tiróide. Este proto oncogene codifica para um recetor membranar com atividade de tirosina-cinase e está envolvido em várias vias de sinalização que controlam processos como a sobrevivência e proliferação celular, migração e angiogénese, entre outros. Os casos de CMTF estão geralmente associados a mutações pontuais a nível germinal no gene RET que podem ser mutações que afetam a região extracelular ou o domínio de tirosina-cinase deste recetor. Nos casos onde não existe qualquer mutação na proteína RET, as cisteínas extracelulares formam ligações de bissulfito intramoleculares, estabilizando o recetor na sua conformação monomérica. O domínio das cisteínas é altamente conservado e tem um papel importante na manutenção da estrutura secundária e terciária do domínio extracelular do RET, através destas ligações de bissulfito. Quando ocorre uma mutação que leva à perda de um resíduo de cisteína esta torna-se livre para formar uma ligação intermolecular com outro receptor mutado, ocorrendo assim a dimerização e fosforilação da proteína RET, tornando-a ativa, mesmo na ausência de ligandos. Assim, mutações ativadoras neste gene conduzem a uma ativação não-regulada destas vias, levando assim ao surgimento do fenótipo tumoral. Este trabalho tem como objectivo a realização de estudos funcionais in vitro para duas variantes germinais do proto-oncogene RET, não descritas na literatura, associadas a dois casos distintos de carcinoma medular da tiróide (referidos como paciente A e paciente B), tentando assim avaliar seu o grau de patogenicidade. A paciente A, sem evidência clínica na família de síndrome NEM2A/2B ou CMTF, foi submetida, aos 79 anos, a tiroidectomia total devido a um CMT unifocal. O teste genético ao gene RET identificou uma variante heterozigótica no codão 636 (ACGATG) no exão 11, que resulta na substituição do aminoácido treonina por metionina na região extracelular da proteína RET, designada por RET T636M. Apenas um membro da família desta paciente foi testado, a filha de 50 anos que apresentava bócio multinodular, tendo-se verificado ser negativa para esta variante. A paciente B tinha 60 anos à data do diagnóstico, tendo sido submetida a tiroidectomia total devido a CMT multifocal. O teste genético ao gene RET revelou uma variante germinal presente em homozigotia no exão 8, codão 515 (TGCTGG), que leva à substituição de uma cisteína por um triptofano no domínio extracelular da proteína RET, designada por RET C515T. O facto dos pais desta paciente serem primos em primeiro grau levou provavelmente a esta variante se apresentar em homozigotia. Esta variante foi também encontrada, apesar de em heterozigotia, em oito de dez familiares estudados. Nenhum destes apresentou qualquer sintoma sugestivo de CMT ou NEM2, exceto uma prima que também veio a desenvolver CMT aos 63 anos. O potencial oncogénico de uma variante pode ser estimado através de diversos ensaios funcionais in vitro, avaliando-se assim sua capacidade de transformação induzida pela mutação comparativamente com o controlo normal, sem mutação. Para estes estudos tem-se em conta as características específicas das células tumorais, que as distinguem das células normais, não transformadas. Para tal, utiliza-se normalmente a linha celular de fibroblastos de ratinho NIH 3T3, comercialmente disponível, sendo analisado o efeito da expressão exógena do péptido mutante nestas células. Antes de se dar inicio aos ensaios funcionais, efetuou-se a análise funcional in silico para prever o efeito patogénico de cada variante. Os ensaios funcionais incluíram o ensaio de formação de focos, migração, crescimento e ciclo celular. A expressão exógena do gene RET nas células transfetadas foi monitorizada e quantificada pela técnica de western-blott. O resultado destes estudos funcionais revelou que as novas variantes do gene RET, RET C515T e RET T636M, em comparação com o efeito induzido pelo RET selvagem, levavam um aumento do crescimento e proliferação celular, à perda de inibição por contacto e um aumento da migração celular. Todas estas características são comuns às células tumorais, levantando-se assim a hipótese de que estas novas variantes podem possuir um potencial oncogénico relevante. O potencial transformante destas novas variantes foi, no entanto, inferior ao observado para a mutação RET C634R, causadora do fenótipo NEM2A e utilizada como controlo positivo neste estudo. Com base nos estudos funcionais in vitro, estas novas variantes apresentam um baixo potencial oncogénico, resultados estes consistentes com o fenótipo pouco agressivo observado em ambas as pacientes deste estudo. Apesar da variante RET T636M não envolver diretamente um resíduo de cisteína, poderá induzir a uma alteração conformacional na proteína que poderá afetar uma ligação intramolecular localizada na vizinhança deste codão. Isto poderá ter um impacto na estrutura da proteína RET, bem como na sua ativação. Curiosamente, esta variante está localizada na vizinhança de certos codões que, quando mutados, estão associados a fenótipos mais agressivos. Por outro lado, a variante RET C515W envolve diretamente um resíduo de cisteína, podendo a sua perda ter consequências diretas na ativação do recetor RET. Indivíduos com mutações pouco patogénicas no gene RET podem necessitar de uma segunda mutação germinal ou somática para desenvolver um fenótipo mais agressivo, que leve à expressão clínica da doença. Esta hipótese foi levantada para a paciente B que possuía a variante em homozigotia, mas foi descartada quando se descobriu que uma prima, que possuía a mesma variante embora em heterozigotia, veio igualmente a desenvolver CMT, sugerindo que apenas um alelo mutado é suficiente para a manifestação da doença. Fatores externos como o estilo de vida de cada indivíduo ou do próprio ambiente em que este se encontra inserido, adicionado ao desenvolvimento tardio da doença, bem como à sua baixa penetrância, são fatores que provavelmente contribuem para as variações na expressão clínica da doença, sendo assim difícil de perceber o efeito da mutação só por si. Apesar de serem necessários estudos funcionais adicionais, a caracterização destas duas novas variantes contribui, não só, para o conhecimento dos mecanismos moleculares inerentes ao desenvolvimento de CMT nestas famílias, como também para a optimização do diagnóstico e o aconselhamento clinico de CMT hereditário.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/9819
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