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Título: Modulação da biodisponibilidade do monóxido de azoto no eritrócito: avaliação do efluxo de GSNO e do efeito do timolol
Autor: Teixeira, Pedro Miguel Araújo Guerreiro
Orientador: Saldanha, Carlota, 1947-
Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-
Palavras-chave: Eritrócitos
Monóxido de azoto
Acetilcolina
Timolol
Teses de mestrado - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: O monóxido de azoto (NO) tem sido amplamente estudado e relacionado com inúmeros processos e patologias no sistema cardiovascular, sendo actualmente reconhecido como um potente regulador do tónus vascular e da hemorreologia. Após a sua formação nas células endoteliais vasculares, o NO: (1) difunde-se para os eritrócitos, onde afecta a agregação e deformabilidade eritrocitárias; (2) difunde-se para a parede vascular onde provoca o relaxamento das células musculares lisas, o aumento do diâmetro dos vasos sanguíneos e do fluxo sanguíneo e, consequentemente, conduz à redução da pressão arterial. O metabolismo de NO no eritrócito origina diversos metabolitos, que podem sofrer alterações dependentes de estímulos externos e internos como a acetilcolina (ACh), substrato natural da acetilcolinesterase (AChE). O glutatião é uma molécula abundante no interior dos eritrócitos, formando nitrosoglutatião (GSNO) ao reagir com o NO. A ligação da ACh à AChE, na membrana do eritrócito, inicia um mecanismo de tradução de sinal que envolve as proteínas Gi e banda 3, estimulando o efluxo de NO. Na presença de velnacrina, um inibidor da AChE, a biodisponibilidade do NO é preservada, i.e., não ocorrem alterações no efluxo de NO. O timolol é um inibidor da AChE. O primeiro objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do timolol na mobilização interna do NO eritrocitário, em condições fisiológicas normais. O segundo objetivo foi averiguar se ocorre efluxo de GSNO concomitante com a saída de NO do eritrócito, após estimulação com efectores da AChE. Para atingir estes objetivos foi estudado o efeito in vitro de moduladores da AChE – ACh e timolol – no NO e nos seus metabolitos – GSNO, S-nitrosohemoglobina (SNO-Hb) e peroxinitritos. Foi colhido sangue por punção venosa de dadores saudáveis (n=18). Para cada amostra de sangue foram preparadas suspensões de eritrócitos incubadas respectivamente com ACh e timolol numa concentração final de 10μM. Foram quantificados os níveis de efluxo de NO, SNO-Hb, peroxinitritos e GSNO. Na presença de timolol, o efluxo de NO no eritrócito é semelhante ao da amostra de controlo, mas significativamente reduzido quando comparado com a amostra contendo ACh. A presença de timolol induz uma redução significativa, no eritrócito, dos níveis de GSNO por comparação com as amostras de controlo e ACh. Os níveis de SNO-Hb e peroxinitritos não são alterados na presença de timolol ou ACh. A ACh e o timolol induzem o efluxo significativo de GSNO, quando comparadas com as amostras de controlo, mas os valores são significativamente reduzidos na presença de timolol quando comparado com as amostras incubadas contendo ACh. É possível concluir que o NO no eritrócito é mantido pelo timolol, in vitro. Pode ser expectável um papel semelhante na microcirculação ocular, quando aplicado como composto terapêutico. Conclui-se igualmente que ocorre o efluxo de GSNO concomitante com a saída de NO, após estimulação com ACh e timolol. Este estudo contribui para aprofundar o conhecimento do metabolismo de NO no eritrócito e, possivelmente, para aplicação de novas terapêuticas com GSNO.
Nitric oxide (NO) has been widely studied and related to several processes and pathologies in the cardiovascular system, and is recognized as a potent regulator of muscular tone and hemorheology. After formation in the endothelial cells, NO: (1) spreads into erythrocytes, regulating erythrocyte aggregation and deformability; (2) spreads into the vascular wall where it causes relaxation of smooth muscular cells, increase in blood vessels diameter and rise of blood flow and, consequently, arterial pressure decrease. NO metabolism inside the erythrocyte generates several derivatives, which can be altered by external and internal stimuli such as acetylcholine (ACh), natural substrate of acetylcholinesterase (AChE). Glutathione is an abundant molecule inside erythrocyte, originating S-nitrosoglutathione (GSNO) by reacting with NO. Binding of ACh to AChE, in the erythrocyte membrane, initiates a signal transduction mechanism that involves Gi and band 3 proteins, stimulating NO efflux. In the presence of velnacrina maleate, an AChE inhibitor, NO bioavailability is preserved, i.e., no changes in NO efflux occur. Timolol is an erythrocyte AChE inhibitor. The first objective of this research was to evaluate the effect of timolol in the internal mobilization of erythrocyte NO, under normal physiological conditions. The second objective was to evaluate the efflux of GSNO, concomitant with the efflux of NO, after stimulation with AChE effectors. To achieve these goals, the in vitro effect of AChE modulators – ACh and timolol – in NO and its metabolites - GSNO, Snitrosohemoglobin (SNO-Hb) and peroxynitrites - were studied. Venous blood samples were collected from eighteen healthy Caucasian men. For each blood sample, erythrocyte suspension were performed and incubated with ACh and timolol maleate in order to achieve 10μM final concentration. Levels of NO efflux, SNO-Hb, peroxynitrites and GSNO were determined. NO efflux by the erythrocyte in presence of timolol is similar to the control sample but significantly decreased when compared to the sample with ACh. The presence of timolol induces significant decrease, in the erythrocyte, of GSNO levels in relation with the control and with ACh samples. SNO-Hb and peroxynitrites levels were not altered by the presence of timolol or ACh. Both timolol and ACh induced significant GSNO efflux in the erythrocyte when compared to the control sample, but values are significantly decreased in the presence of timolol when compared with ACh. In conclusion, the NO content in the erythrocyte is maintained by timolol maleate, in vitro. It may be expected the same role for timolol in the ocular microcirculation when applied as a therapeutic compound. In addition, when stimulated with ACh or timolol, GSNO efflux occurs, associated with NO efflux. This brings new insight to the metabolism of NO inside the erythrocyte and new possible therapeutic applications for GSNO.
Descrição: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/9880
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