Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/9907
Título: Design of polyvinyl alcohol networks as supports for protein immobilization
Autor: Nunes, Mário, 1977-
Orientador: Wadepohl, Hubert, 1954-
Calhorda, Maria José, 1949-
Palavras-chave: Teses de doutoramento - 2013
Data de Defesa: 2013
Resumo: Polyvinyl alcohol (PVA) is a water-soluble, biocompatible and biodegradable synthetic polymer. PVA-based matrices have been shown to lead to particles suitable for the immobilization of biological agents, mostly whole cells, for application in biocatalysis, given the chemical and mechanical stability, superior to those of most natural polymers. PVA provides thus a suitable alternative for such polymers in the production of immobilized biocatalysts.Naringinase is an enzyme complex expressing α-L-rhamnosidase and β-D-glucosidase activities. Naringin was the substrate used in this bioconversion, and the product, naringenin. These are compounds with biological and pharmacological activities, such as anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-cancer, showing a high potential in the pharmaceutical industry.The main focus of this study is in the investigation and optimization of the immobilization of naringinase from Penicillium decumbens in PVA networks, and application of the resulting immobilized biocatalyst in naringin hydrolysis, in a scalable and reproducible way.Immobilization parameters such as most suitable crosslinker, catalyst, inorganic salt, co-solvents and solidification process were identified to establish and investigate the feasibility of the PVA, alginate and PVA-alginate methods to form lens-shaped particles, in terms of enzyme activity and stability. Major improvements, were established to ensure better and reproducible immobilization conditions. Some common problems were overcome, such as toxicity, through the use of a less toxic crosslinker, like glutaraldehyde and the innovative use of boronic acids in the production of hollow PVA microspheres instead of boric acid; the possibility to control matrices porosity and structure was made available, through the combined use of the co-solvent DMSO and boronic acids; and uniformity of particle size and shape through the design an implementation of suitable set-up. Moreover, new methodologies and apparatus were designed and implemented that allowed the production of immobilized biocatalysts in different formats, namely solid and hollow microspheres, lens-shaped particles and electrospun microfibers.The response surface methodology (RSM) was used to further optimize immobilization conditions and understand the significance and interaction of the pre-established important factors, in this case co-solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) and crosslinker (glutaraldehyde) concentration, affecting the swelling ratio, encapsulation efficiency and residual activity in these particles. The results indicated that these variables were significant and quadratic polynomial equations were obtained.The PVA biocatalysts displayed unique features depending on the specific formulation. Solid beads in a blend of PVA/alginate crosslinked with boric acid, retained 52% of its initial activity during 6 days. A significant improvement was observed when lens-shaped particles produced from a blend of PVA /DMSO crosslinked with glutaraldehyde, since the biocatalyst allowed for a conversion yield in excess of 78%, during 24 days of operation under consecutive batch runs. Moreover, an encapsulation efficiency of 98.6% was observed. Continuous naringin hydrolysis promoted by this immobilized biocatalyst was performed in a packed bed reactor. The biocatalyst activity remained constant for 40 days of continuous operation allowing for a specific productivity of 9.07 mmol.h−1 genzyme-1 and a reuse half-life time of 48 days. These results are illustrative of the influence of the chemical nature of the agents involved in the formation of the PVA matrix on the performance of the resulting biocatalyst. The introduction of boronic acids as cross-linking agents, as alternative to glutaraldehyde, proved also an effective approach. The resulting hollow microspheres, produced through a simple methodology, displayed a promising operational stability, since no loss of activity was observed throughout 7 consecutive batch 24 h-runs, making this biocatalyst a promising candidate for application in a continuous process for naringin hydrolysis.. Immobilization of naringinase in PVA electrospun fibers was also achieved successfully, illustrating the possibility of producing a PVA-based biocatalyst with high specific area while doing away with chemical crosslinkers or organic solvents. The fibrous material displayed good mechanical and thermal endurance in aqueous systems, when compared with other chemical crosslinked fibrous biocatalyst. Moreover, it retained an average of 68 % (at 45ºC) and 100% (at 25 ºC) of its initial activity after 188 or 216 hours of operation time, respectively.Selection of the most adequate reactor configuration and mode of operation envisaging large scale hydrolysis was also performed. This initial approach to the process scale design, comprises bioconversion trials at two different scales, shaken microtiter (volume <5 ml) and minibioreactor (volume <30 mL). Geometrical and dynamic (i.e. Reynolds number) scale parameters relations were analyzed, using different reactor geometries (round and square well microtiter) and flow patterns (axial and radial flow). At mini scale reactors, axial flow promotes slightly higher naringin bioconversion; and at microtiter scale, geometry of the well did not cause major effect. For microtiter versus minireactors scale, at constant Reynolds number and impeller tip speed, revealed similar naringin bioconversion with PVA immobilized naringinase lens-shaped particles. Further studies must be envisaged.
O álcool polivinílico (PVA) é um polímero sintético solúvel em água, biocompatível e biodegradável. Matrizes à base de PVA têm sido desenvolvidas para a imobilização de agentes biológicos, principalmente células, e para aplicação na biocatálise, dada a superior estabilidade química e mecânica destes polímeros em relação aos polímeros naturais. O PVA surge assim como uma promissora alternativa na produção de biocatalisadores imobilizados.Naringinase é um complexo enzimático formado por uma β - D -glucosidase e α -L- rhamnosidase. A naringina foi o substrato utilizado nesta bio conversão, e o produto, naringenina. Estes são compostos com importantes atividades biológicas e farmacológicas com elevado potencial para a indústria farmacêutica, tais como propriedades anti- oxidantes, anti - inflamatórias e anti – carcinogénicas.O objetivo deste estudo está na investigação e na otimização da imobilização de naringinase obtida do fungo Penicillium decumbens em redes de PVA e sal aplicação como biocatalisador imobilizado, resultando na hidrólise da naringina, de forma assegurar reprodutibilidade e um possível aumento de escala de produção.Parâmetros de imobilização, tais como a escolha do agente de reticulação, catalisador, sal inorgânico, co-solventes e processo de solidificação mais adequado foram identificados para estabelecer e investigar a viabilidade do PVA como polímero para imobilização enzimática. Partículas de PVA, PVA-alginato e alginato foram produzidas e testada a atividade enzimática e estabilidade da enzima imobilizada. Garantindo sempre as melhores condições de imobilização e assegurando a reprodutibilidade. Alguns problemas comuns foram superados, tais como toxicidade, através da utilização de um de agentes de reticulação menos tóxicos, tais como o glutaraldeído, e a utilização de ácidos borónicos, para a produção de microesferas ocas de PVA em vez de ácido bórico.Foi possível controlar a porosidade e estrutura da matriz através do uso combinado de DMSO e ácidos boronicos. Além disso, novas metodologias e aparelhos foram concebidos e implementados, que permitiu a produção de biocatalisadores imobilizados em diferentes formatos, esferas compactas e microesferas ocas, lentes e microfibras.A análise de superfície de resposta (RSM) foi utilizada para otimizar as condições de imobilização e compreender a Acão da concentração do agente reticulante, glutaraldeido, e co –solvente DMSO na eficiência de encapsulação e atividade residual nestas partículas. Os resultados indicaram que essas variáveis foram significativas e equações polinomiais quadráticas foram obtidas.Os biocatalizadores de PVA desenvolvidos possuem características únicas que os tornam uma mais-valia em diversas aplicações. A enzima retida nas esferas de PVA-alginato produzidas através da reação com ácido bórico, manteve uma atividade residual de 52%, durante 6 dias. Observou-se uma melhoria significativa destes valores de estabilidade nas lentes de PVA/DMSO permitindo uma atividade residual de 78%, durante 24 dias de funcionamento. Observou-se também uma eficácia de encapsulação de 98,6 %.A hidrólise contínua da naringina foi realizada num reator de leito fixo com o biocatalizador imobilizado. A atividade do biocatalisador permaneceu constante durante 40 dias de operação contínua permitindo uma produtividade específica de 9,07 mmol.h-1.Genzym -1 e um tempo de meia-vida de 48 dias. Estes resultados são ilustrativos da influência da natureza química dos agentes envolvidos na formação da matriz de PVA no desempenho do biocatalisador resultante. A introdução de ácidos borónicos como agentes de reticulação, como alternativa ao glutaraldeído, mostrou também uma abordagem eficaz. Microesferas ocas de PVA, foram produzidas com recurso a uma metodologia simples, garantindo uma estabilidade operacional bastante promissora, uma vez que não foi observada nenhuma perda de atividade ao longo de 7 dias consecutivos, fazendo deste biocatalisador um potencial candidato para aplicação em processos contínuos de bioconversão da naringina. A Imobilização da naringinase nas nanofibras através da técnica de electrosppining foi realizado com sucesso, ilustrando a possibilidade de produzir uma biocatalizador composto por PVA com uma elevada are se superfície sem recurso a solventes orgânicos ou agentes químicos de reticulação. As nanofibras de PVA apresentam uma boa resistência mecânica e térmica em sistemas aquosos, quando comparado com as nano fibras de PVA resultantes do processo químico de reticulação. Além disso, a enzima contida neste tipo de suportes conseguiu reter uma atividade residual media de 68% ( a 45 º C) e 100% ( a 25 º C ) após 188 ou 216 horas de operação, respetivamente.A seleção do reator e o modo de operação mais adequado paras estes tipos de biocatalizadores foi também testada, prevendo o um possível aumento de escala.Esta abordagem, para o desenvolvimento da escala do processo, compreende os ensaios de bioconversão em duas escalas diferentes, microescala, atraves do uso de microplcas agitadas orbitalmente (volume <5 ml) e minibioreactor (volume <30 ml). As relações geométricas e dinâmicas entre reatores utlizados no processo de aumento de escala foram analisados, utilizando-se reatores de diferente geometria (microplacas de fundo redondo e fundo plano) e padrões de fluxo distintos (fluxo axial e radial). Nos min reatores, o fluxo axial promove bio conversões da naringina ligeiramente superiores e em microplaca, a geometria do poço não causou grande efeito na actividade enzimática do sistema imobilizado. Mantendo constantes os parâmetros, número de Reynolds e velocidade na extremidade do agitador em ambas as escalas, obtivemos bioconversões semelhantes da naringina pela enzima imobilizada nas lentes de PVA.A elevada atividade e estabilidade operacional registada pela enzima imobilizada nestes tipos de biocatalizadores de PVA, permitem destacar o elevado potencial desta estratégia na melhoria contínua propriedades das proteínas encapsuladas neste tipo de hidrogel.
Descrição: Tese de doutoramento, Farmácia (Biotecnologia Farmacêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/9907
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