Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10451/9991
Título: Testing the mechanosensory versus chemosensory hypotheses in left-right early development
Autor: Fonseca, Catarina Gonçalves
Orientador: Lopes, Susana Santos
Feijó, José A., 1962-
Palavras-chave: Embriologia animal
Teses de mestrado - 2013
Expressão génica
Lateralidade
Data de Defesa: 2013
Resumo: Os cílios são organelos semelhantes a antenas que se projetam para fora da célula em todas as células de vertebrados. Existem dois tipos de cílios que são classificados de acordo com a sua função: cílios móveis, que estão envolvidos no movimento de fluidos e cílios primários (mais pequenos e imóveis) que têm funções sensoriais e sinalizadoras. Dependendo da sua função e localização nos epitélios ou órgãos a estrutura ciliar é também diferente. Alterações ao nível da motilidade ciliar causam doenças específicas do cílio que afetam principalmente o aparelho respiratório, a fertilização e o estabelecimento da assimetria esquerda-direita do corpo. O nó embrionário, também conhecido como organizador da esquerda-direita do embrião vertebrado, é uma estrutura ciliada onde os cílios móveis originam um importante fluxo de fluido, chamado de Fluxo Nodal (necessário para a formação do eixo esquerdo-direito). Por vezes há falhas na correta formação do padrão esquerdo-direito durante o desenvolvimento que levam ao aparecimento de defeitos como situs inversus. O mecanismo pelo qual este processo ocorre é ainda desconhecido mas existe informação na área que suporta duas vias: mecano-senora e quimio-sensora. Assim, existem dois modelos que tentam explicar como é que ocorre a ativação da expressão de genes assimétrica e como é que esta informação é transferida para a placa lateral da mesoderme. O “Modelo dos Morfogénios” defende que determinados morfogénios são transportados do lado direito para o lado esquerdo do nó, em resposta ao fluxo nodal e ficam concentrados do lado esquerdo onde iniciam uma sinalização intracelular. O outro modelo, conhecido como “Modelo dos Dois tipos de Cílios”, sugere que existem dois tipos de cílios diferentes a desempenharem funções distintas no nó. Este modelo foi baseado na descoberta de que no nó embrionário do rato existem cílios móveis, na zona central, identificados pela presença de dineínas (proteínas motoras que conferem o movimento ciliar), mas também existem cílios imóveis a cercar os cílios móveis. Estes cílios imóveis foram localizados por imunofluorescência na zona mais periférica do nó, também conhecida por região perinodal. Ambos os modelos descrevem que a libertação de Ca2+ intracelular do lado esquerdo do nó é um fator essencial para a ativação da expressão assimétrica de genes envolvidos no estabelecimento do padrão esquerdo-direito. A partir de dados novos, ainda não publicados, obtidos após a análise de resultados de uma experiencia de expressão genética usando microarrays, feita no nosso laboratório, foram escolhidos dois genes de acordo com a sua expressão na vesicula de Kupffer (orgão análogo ao nó do rato, importante também no estabelecimento da assimetria esquerda direita no peixe zebra e medaka). Usaram-se embriões selvagens (wt) e mutantes deltaD-/- para podermos comparar as diferenças de expressão nestas duas condições em embriões de peixe zebra. Um dos genes escolhidos foi o tas1r1 (pertencente à família de recetores de sabor Tas1R normalmente expressos no bolbos gustativos da boca). Uma vez que, tinha sido descrita a sua expressão em epitélios ciliados e espermatozoides, atuando como sensores químicos. O outro gene escolhido para o estudo foi o pkd1 porque tinha sido descrito que nas células ciliadas do rim o Pkd1 interage com o Pkd2 de modo a formarem um complexo importante para a homeostase deste órgão. Deste modo, com o tas1r1 fomos estudar o modelo dos Morphogenios e se este gene tem algum papel relevante como sensor-químico no cílio da vesicula de Kupffer. Por outro lado, com o pkd1 fomos testar o modelo dos Dois Tipos de Cílios, de modo a tentar perceber se este também tinha um papel importante como sensor mecânico para o estabelecimento do padrão esquerdo-direito. Para tal utilizamos a tecnologia de injeção de morpholino de modo a eliminar a tradução destes dois genes (independentemente) para avaliarmos se a sua ausência leva ou não a defeitos de lateralidade no desenvolvimento embrionário. Antes de iniciar esta experiência procedemos à confirmação da microaray através da técnica de qPCR em embriões wt e mutantes para o pkd1 e para embriões wt a diferentes estádios (10 hpf, 13 hpf e 4 dpf) de modo a validar a expressão do tas1r1. Para confirmar se ambos os genes têm um papel importante para o estabelecimento do eixo direito-esquerdo do corpo, procedeu-se à avaliação da posição dos órgãos internos, nomeadamente o coração (às 30 horas) e o fígado e pâncreas (às 50 horas). Para o coração os embriões, vivos, foram vistos à lupa, a qual permitiu que se observasse o bater do coração por baixo do olho esquerdo (para embriões normais), do olho direito ou entre os dois olhos para embriões com defeitos de lateralidade. O fígado e pâncreas foram observados de duas formas distintas, umas delas foi usando uma linha transgénica de peixe zebra foxj1a:GFP que marca estes dois órgãos a verde e por isso estes embriões foram visualizados vivos à lupa de fluorescência. A outra forma de avaliação foi pelo uso de sonda de hibridação in situ especifica para marcar estes dois órgãos. Após a análise da posição destes três órgãos concluímos que os embriões não possuíam defeitos de lateralidade. Assim, seguimos o nosso estudo com a hipótese do modelo dos Dois Tipos de Cílios mas com outro gene, o pkd2, uma vez que já está descrita a sua importância a nível do estabelecimento do padrão esquerdo-direito no corpo. Além de analisar e confirmar o fenótipo já descrito ao nível dos defeitos de lateralidade observados pela posição do coração e do fígado e pâncreas, usando a tecnologia de injeção de morpholino, concluímos o nosso estudo com a avaliação da expressão de pkd2 nos cílios da vesicula de Kupffer. Nestes estudos percebemos que a expressão de Pkd2 não é igual em todos os cílios e que pode estar não só nos cílios imoveis, como descrito pela sua função mecano-sensora no nó do rato e na vesicula de kupffer do peixe medaka. Isto deixa em aberto a hipótese de que os cílios moveis poderão desempenhar funções sensoras além de funções de movimento e formação de fluxo na vesicula. Como estudos futuros será importante obter um construto para expressar Pkd2 em embriões de peixe zebra vivos, através da injeção deste no embrião. Desta forma será possível fazer estudos de co-localização com arl13b-GFP que permitirão observar os cílios que estão em movimento e os cílios que não têm movimento, ao longo de toda a vesicula de Kupffer. Isto é possível devido ao facto da proteína Arl13b ser uma proteína de membrana e como tal está presente quer em cílios móveis quer em cílios imóveis. Deste modo ao fazermos esta experiência podemos perceber em que tipo de cílios se encontra o Pkd2 e a sua distribuição pela vesicula de Kupffer. Mais ainda, podemos tentar fazer estudos funcionais dos cílios móveis, de modo a perceber se realmente há ou não um papel deste tipo de cílios a nível mecano-sensor e qual a sua contribuição a nível sensorial no estabelecimento do correto padrão esquerdo-direito do corpo. Esta abordagem poderia ser feita pela supressão genética dos cílios imóveis de modo a perceber se os cílios móveis são suficientes para desempenhar a sua função de gerar o fluxo e ainda ter a capacidade de sentir os estímulos mecânicos gerados sem comprometer o estabelecimento do correto padrão esquerdo-direito do corpo. Concluindo, o estudo feito nesta dissertação foi relevante na medida em que proporcionou novos dados relativamente à localização do Pkd2 no cílio e na vesicula de Kupffer, levando assim ao aparecimento de novas hipóteses que devem e têm de ser testadas no futuro.
Cilia are antenna-like organelles that protrude out of nearly all vertebrate cells. Two types of cilia can be defined: motile cilia, involved in moving fluids and primary cilia (shorter and immotile) that have sensory and signalling functions. Motile ciliary dysfunctions cause specific ciliopathies that affect mainly the respiratory tract, fertilization and left-right (LR) body establishment. The embryonic node is a ciliated structure where motile cilia generate an important fluid-flow named Nodal Flow (necessary for LR axis formation). Correct left-right patterning sometimes fails during development and defects, such as situs inversus occur. The correct left-right axis formation is highly dependent on signalling pathways downstream of such directional fluid-flow. The mechanism by which this process occurs is still unknown but there are supporting data in the field both for mechano and chemosensory pathways. There are two models that try to explain the mechanism by which LR is transferred to the Lateral Plate mesoderm. The “Morphogen model” – defends that morphogens become concentrated in left side of the node in response to flow. The other model, known as the “Two-cilia model” suggests that two different cilia types in the node perform different functions. From an unpublished microarray data we chose two genes in order to study these two models in zebrafish. “Morphogen Model” was studied with Tas1r1, because it has been recently reported that Tas1R receptors are expressed in ciliated epithelia acting as chemosensors. The “Two-cilia model” was studied with the pkd1 gene, because in kidney ciliated cells was described that Pkd1 interacts with Pkd2 originating a mechanosensor complex important for kidney homeostasis. Knockdown of both genes with morpholino technology was used (independently) in order to observe if the lack of these genes caused left-right defects. Results showed that tas1r1 knockdown does not seem to generate any LR defects. Regarding Pkd1 we could not make definitive conclusions because the morpholino we designed was in a projected sequence.
Descrição: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
URI: http://hdl.handle.net/10451/9991
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