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Publicação
Detection and characterization of Dichelobacter nodosus from sheep with different clinical manifestations of Ovine Footrot
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A Peeira é uma doença que afecta ovinos e outros ruminantes, sendo atualmente uma das principais causas de claudicação em ovelhas. Tem como principal agente patogénico a bactéria gram-negativa anaeróbica Dichelobacter nodosus. Esta doença tem grandes impactos económicos e relevância em termos de bem-estar animal, tornando-se por isso essencial o seu controlo, tratamento e erradicação. Existem essencialmente duas manifestações clínicas desta doença. A manifestação ligeira consiste na inflamação da epiderme interdigital, sendo por essa razão denominada Dermatite Interdigital (ID – Interdigital Dermatitis). Por outro lado, na manifestação mais grave, esta inflamação pode progredir e causar a separação do casco e do tecido subjacente, sendo por essa razão chamada de Peeira Grave (SFR – Severe footrot). A severidade desta doença está principalmente dependente de três fatores: a virulência da estirpe infectante de D. nodosus, as condições ambientais e a resistência natural do hospedeiro. Alguns dos fatores ambientais que contribuem para a progressão e transmissão da doença são a temperatura, a humidade e o tipo de solo. Foi também demonstrado que a coinfecção com bactérias de outros géneros desempenha um papel deveras importante no desenvolvimento e progressão da doença. Algumas das bactérias oportunistas que foram identificadas na pele interdigital de ovinos com Peeira são Fusobacterium necrophorum e Treponema spp.. O papel exercido por estas bactérias oportunistas na progressão da doença ainda não é totalmente compreendido. Verificou-se, no entanto, que F. necrophorum, também uma bactéria gram-negativa anaeróbica, contribui para o desenvolvimento e progressão da peeira e que exerce uma relação sinergística com D. nodosus, tornando esta bactéria oportunista um foco central no estudo da doença. Em relação à virulência de D. nodosus, os dois factores principais reconhecidos são as fímbrias do tipo IV e as proteases extracelulares. A análise das fímbrias permite a discriminação de dez serogrupos (A-I e M) com base na sua diversidade estrutural que é causada por variações na região carboxi-terminal da subunidade fimbrial, também chamada proteína FimA e codificada pelo gene fimA. A protease acídica 2 (AprB2/V2), em particular, é um importante fator de virulência responsável pela atividade de elastase presente nas estirpes virulentas que, por sua vez, é essencial para o desenvolvimento das lesões características da Peeira. Os genes aprV2 e aprB2 diferem apenas numa substituição de dois pares de base (TA/CG) na posição 661/662, o que resulta na alteração de um aminoácido (Tyr92Arg) na proteína madura, sendo que esta alteração determina a atividade de elastase. O principal objetivo do presente estudo foi determinar a prevalência de D. nodosus e F. necrophorum em ovelhas da região do Alentejo com diferentes manifestações de Peeira e isolar e caracterizar D. nodosus quanto à sua virulência e serogrupo. Foram utilizadas amostras de tecido da epiderme interdigital provenientes de ovelhas saudáveis (grau 0) e com Peeira (graus 1-5) de 17 explorações de 13 concelhos da região do Alentejo. Amostras de DNA das biópsias recolhidas (n=261) foram utilizadas para a deteção e identificação de D. nodosus e F. necrophorum e para determinar a virulência e os serogrupos de D. nodosus. Estes testes foram realizados através de PCR em tempo real. Os fatores de virulência foram ainda caraterizados com recurso a sequenciação de Sanger. A determinação dos serogrupos foi realizada por PCR em formato multiplex. O isolamento de D. nodosus a partir de amostras de biópsia foi realizado por cultura bacteriológica em meios seletivos. Os resultados deste estudo mostraram que, na região do Alentejo, existe uma prevalência de D. nodosus (51%, n= 132) e F. necrophorum (46,4%, n=121) elevada em casos clínicos de Peeira. Verificou-se também uma associação entre a prevalência destes dois agentes e a severidade da lesão, ou seja, com a progressão da doença para fases mais avançadas. D. nodosus não foi detetado em quatro das 17 explorações em estudo enquanto F. necrophorum apenas estava ausente numa dessas explorações. Observou-se ainda uma tendência para explorações com um maior número de animais infetados por D. nodosus também apresentarem uma elevada prevalência de F. necrophorum. A coinfecção por ambas as espécies é a situação epidemiológica mais comum, estando associada a uma maior severidade da doença, quando comparada com as situações em que se registou infeção apenas com D. nodosus. Em relação à prevalência geográfica de D. nodosus, este foi detetado em 11 dos 13 concelhos, não se tendo detetado no Alandroal e Moura. As prevalências mais elevadas foram registadas em Almodôvar (83%), Portel (72,4%) e Évora (68%). A análise dos fatores de virulência nas amostras de DNA de biópsia onde D. nodosus foi detetado (n=132) revelou que a maioria dos isolados (n=127) era virulenta, com exceção de cinco cujo resultado foi indeterminado. Com base em critérios espaciais e qualitativos, das 132 amostras de DNA de biópsia positivas para a presença de D. nodosus foram selecionadas 53 para a determinação dos serogrupos, tendo-se confirmado o serogrupo em apenas 19 dos casos, distribuídos nas seguintes proporções: serogrupo B (90%), serogrupo C (5%) e serogrupo F (5%). Quanto à cultura bacteriológica, das 132 amostras processadas onde foi detetado D. nodosus foram obtidos 17 isolados identificados como D. nodosus por PCR em tempo real, tendo estes sido caraterizados quanto à virulência e serogrupo a partir de DNA extraído de culturas puras. Com a exceção de um isolado, os resultados dos testes de virulência foram concordantes com os resultados obtidos nas amostras de DNA de biópsia, confirmando os isolados como virulentos. O serogrupo de 15 dos 17 isolados foi identificado, tendo dois permanecido indeterminados. Os 15 isolados pertenciam a seis diferentes serogrupos, B, C, F, G, D e H, sendo que a maioria dos isolados pertencia ao serogrupo B (40%). O segundo serogrupo mais comum foi o serogrupo C (20%), seguindo-se, na mesma proporção, os serogrupos H e G (13%). Combinando os resultados provenientes da análise por PCR multiplex de DNA de biópsia total e de DNA de culturas puras, determinou-se os serogrupos de 29 (22%) das 132 amostras de ovelhas positivas para D. nodosus. Estes 29 serogrupos foram identificados em animais de explorações de oito dos 11 concelhos positivos para D. nodosus (73%), tendo o serogrupo B sido detetado em sete concelhos com a exceção de Odemira. Em contraste, os serogrupos D e H só foram encontrados num concelho cada (Portel e Ponte de Sôr, respectivamente). Em relação à localização geográfica, é importante mencionar a elevada prevalência em concelhos geograficamente próximos, incluindo o concelho de Évora (68%), Portel (72,4%) e Alvito (65,4%). Dois outros municípios com elevada prevalência são Almodôvar (83%) e Odemira (67%), os concelhos mais a sul incluídos neste estudo e também geograficamente próximos. Interessantemente, os três concelhos com menor prevalência aparente, Alandroal (0%), Moura (0%) e Serpa (20%), situam-se perto da fronteira com a Espanha. O presente estudo parece indicar que, na região do Alentejo, existe uma elevada prevalência de D. nodosus, assim como de F. necrophorum, em casos clínicos de peeira. Confirmou-se uma relação entre as duas espécies bacterianas, sendo que a infeção por D. nodosus é influenciada pela presença de F. necrophorum. Os resultados obtidos sugerem ainda que esta espécie bacteriana atua como agente patogénico secundário, aumentando a severidade das lesões e estando envolvida predominantemente nas fases mais tardias da Peeira. Conclui-se também que as estirpes de D. nodosus presentes nesta região de Portugal são maioritariamente estirpes virulentas e que os serogrupos mais comuns são os serogrupos B e C. Verificou-se ainda que poderão existir possíveis “hotspots” de infeção por D. nodosus nas zonas em torno do concelho de Évora e no sul do Alentejo, junto aos concelhos de Almodôvar e de Odemira. Esta investigação consiste no segundo estudo realizado em Portugal com foco na caracterização da Peeira e no primeiro com a utilização de métodos atualizados de diagnóstico e caracterização molecular de D. nodosus (PCR em tempo real e PCR multiplex). Os resultados desta dissertação salientam a importância do estudo da Peeira em Portugal, tendo em consideração a sua elevada prevalência e a virulência das estirpes de D. nodosus. A identificação dos serogrupos predominantes e a caraterização dos isolados neste estudo epidemiológico é um primeiro passo para um melhor controlo e possível erradicação da doença no país, nomeadamente através da implementação de medidasimunoprofiláticas e medidas de biossegurança nas explorações afetadas e noutras que, com estas, mantêm relações comerciais.
Descrição
Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
Palavras-chave
Peeira Dichelobacter nodosus PCR em tempo real Virulência Serogrupo Teses de mestrado - 2020