Exploring new facets of interleukin-7 receptor-mediated signaling in T-cell leukemia

Abstract

Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common childhood malignancy with 15% of children and 25% of adult ALL cases presenting with a T-cell phenotype (TALL), which is associated with higher risk and poorer prognosis. Interleukin-7 (IL-7) is a cytokine crucial for normal T-cell development. However, IL-7 and its receptor (IL-7R) can also partake in T-cell leukemia. In fact, it was previously described that around 10% of T-ALL patients display gain-of-function mutations in the IL7R gene (that codes for IL-7Rα). These mutations promote homodimerization of the receptor and consequent ligand-independent constitutive activation of the downstream pathways (namely JAK/STAT and PI3K/Akt/mTOR) leading to cell transformation in vitro and tumorigenic ability in vivo. The non-requirement for the ligand brings up the possibility of the mutant receptor being able to signal from intracellular compartments, even before reaching the plasma membrane, which could provide leukemic cells an evasion strategy towards a possible IL-7R targeted therapy. The current thesis pretends to tackle this hypothesis by first determining whether the mutant receptor has intracellular activity and then by defining the exact location from which this putative activity occurs. Our results indicate that intracellularly located mutant IL-7R is capable of promoting cell viability through the activation of its associated downstream pathways. To try to identify the location in which this process occurs, the current work explored the possibility of the receptor promoting downstream signaling from the endoplasmic reticulum (ER). By using the method of retention using selective hooks (RUSH) it was possible to establish preliminary results suggesting that the mutant receptor has some activity in this compartment, although not optimal. Altogether our results suggest that the mutant IL-7R is capable of promoting signaling form within the cell, in part from the ER and possibly somewhere along the trafficking route between this organelle and the plasma membrane.

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o cancro infantil mais comum, apresentando uma incidência de 25% em crianças com menos de 15 anos. Esta doença caracteriza-se por um aumento de proliferação anormal de linfócitos imaturos com origem na medula óssea. A leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) é um subtipo de LLA que consiste na transformação de progenitores de células T. Este subtipo de leucemia constitui 15% dos casos de LLA-T pediátricos e 25% dos casos em adultos. A abordagem terapêutica utilizada para este cancro passa maioritariamente pela administração de regimes de quimioterapia multiagente, que se têm mostrado altamente eficazes, principalmente em casos pediátricos. Contudo, cerca de 20% dos casos pediátricos e 40% dos adultos sofrem recidivas, normalmente associadas a baixa resposta a terapêutica de segunda linha. Assim, existe uma elevada necessidade de criar novos tipos de tratamento em LLA-T, mais eficazes, menos tóxicos e mais específicos. Com o conhecimento das principais mutações, moléculas e vias de sinalização envolvidas nesta doença, o interesse em desenvolver terapias dirigidas tem crescido significativamente. A interleucina-7 (IL-7) é uma citocina com um papel fundamental durante o desenvolvimento normal de células T. IL-7 interage com o seu receptor (IL-7R), um heterodímero composto por uma subunidade IL-7Rα e pela subunidade γc (partilhada com outros receptores de interleucinas da mesma família). As principais vias de sinalização activadas por IL-7R são as vias JAK/STAT e PI3K/Akt/mTOR, que desempenham um papel fulcral na manutenção da viabilidade celular e progressão no ciclo celular. Apesar de essencial para o desenvolvimento de linfócitos T, IL-7 também se encontra envolvida no desenvolvimento de LLA-T, sendo que a sobreactivação das vias mediadas por esta interleucina promovem a proliferação de células leucémicas tanto in vitro como in vivo. Para além disso, cerca de 10% dos casos de LLA-T pediátrica e 2% dos casos em adultos apresentam mutações heterozigóticas de ganho de função no exão 6 do gene IL7R, que codifica a subunidade IL-7Rα do receptor de IL-7. Estas mutações levam maioritariamente à inserção de uma cisteína de novo na região justamembranar do receptor, que possibilita a formação de pontes dissulfeto entre subunidades IL-7Rα, tornando possível a homodimerização do receptor. O receptor mutado adquire a capacidade de promover sinalização constitutivamente, sem necessitar de se ligar a IL-7 para este efeito. O potencial que estas mutações têm em LLA-T faz com que IL-7Rα constitua um alvo bastante atractivo para o desenvolvimento de novas terapias dirigidas para este cancro. De acto, já existem diversos inibidores de moléculas envolvidas na sinalização mediada por IL-7R, contudo, não foi ainda desenvolvida nenhuma droga direccionada para a inibição do receptor em si. A abordagem que actualmente se encontra a ser explorada para este efeito consiste na criação de anticorpos anti-IL-7Rα que inibem a actividade do receptor. A utilização destes anticorpos é viável tendo em conta que IL-7Rα é uma proteína de membrana tipo 1, encontrando-se expressa à superfície das células. Sabendo que as mutações que ocorrem em IL7R proporcionam independência de IL-7 para o funcionamento do receptor mutado e tendo em conta que IL-7Rα é uma proteína membranar que é transportada através da via secretória até à membrana plasmática, o principal objectivo desta tese é determinar se IL-7R mutante tem a capacidade de promover sinalização a partir de dentro da célula. Para responder a esta questão foram utilizadas células Ba/F3 transduzidas com o receptor (mutante ou wild-type) e isoladas por forma a expressarem o IL-7R na superfície celular ou apenas intracelularmente. Os ensaios efectuados com este modelo revelaram que, de facto, o receptor mutante tem a capacidade de promover a ativação das vias JAK/STAT e PI3K/Akt/mTOR, promovendo assim viabilidade e proliferação celular. O mesmo não foi constatado no caso do receptor wild-type, uma vez que as vias de sinalização não se encontravam activas. Seria interessante confirmar que de facto a actividade intracelular do receptor se encontra diretamente relacionada com a viabilidade celular neste modelo, utilizando inibidores de JAK1 (o elemento mais acima, que interage diretamente com IL- 7Rα), uma vez que inibidores capazes de interagir com IL-7Rα intracelular não se encontram disponíveis. A segunda parte deste trabalho tem como objectivo determinar o compartimento intracelular no qual o receptor mutante se encontra ativo. O compartimento escolhido para iniciar este estudo foi o reticulo endoplasmático (RE), uma vez que: a) este constitui o primeiro compartimento no qual IL-7Rα se insere após tradução, e que b) as modificações pós-tradução que este sofre mais à frente na cadeia de transporte não parecem influenciar a capacidade do receptor mutante homodimerizar (um requerimento para a sua capacidade de promover sinalização constitutiva). Foi então necessário encontrar uma técnica que permitisse uma retenção eficaz do receptor no RE, não colocando as células sob stress e permitindo uma libertação regulada do receptor para a membrana plasmática. Assim, utilizou-se o método de retention using selective hooks (RUSH), formado por um hook, constituído por uma molécula de streptavidina contendo um motivo de retenção para o RE (neste caso KDEL) e por um reporter, que consiste na proteína de interesse (nesse caso IL-7Rα) associada a uma proteína que interage com a streptavidina e uma molécula que confere fluorescência (neste caso EGFP). A interacção entre estes dois componentes leva a uma retenção do receptor no RE, facilmente revertida através da adição de biotina. O funcionamento do sistema foi avaliado através de microscopia confocal e citometria de fluxo, sendo que esta última revelou algum grau de ineficiência na retenção de IL-7Rα, encontrando-se este presente, embora em baixos níveis, na superfície celular mesmo na ausência de tratamento com biotina. Esta retenção ineficiente mostrou ter um claro impacto na sinalização mediada pelo receptor. Assim, tentativas foram feitas para ultrapassar este problema através de sorteio por FACS das células transfectadas por forma a isolar aquelas que não apresentavam qualquer presença do receptor à superfície. Esta abordagem demonstrou-se difícil, uma vez que o processo utilizado para inserção do sistema nas células foi transfecção transiente e, como tal, não só eram necessárias elevadas quantidades de células e DNA para ter uma quantidade de proteína pós-sorteio suficiente para analisar, como as células não recuperavam deste processo de sorteio a tempo de serem realizadas experiências antes de os níveis de expressão do DNA inserido diminuírem. Assim, apenas foi possível realizar uma experiência, tendo sido obtidos resultados preliminares que indicam que de facto existe alguma actividade do receptor aquando da sua retenção no RE. Contudo, esta actividade apresenta níveis subóptimos, quando comparada com a atividade do receptor à superfície da célula. Em resumo, os resultados apresentados neste trabalho sugerem a existência de actividade intracelular de IL-7Rα mutado, capaz de promover viabilidade e proliferação celular. O local (ou locais) onde esta actividade tem lugar não é contudo claro, parecendo existir já alguma aquando da localização do receptor no RE. No entanto, o local (i.e. o organelo ou estrutura intracelular) onde esta começa a adquirir níveis tão elevados como na superfície celular, se é que tal acontece, não está ainda determinado. Assim, será essencial o desenvolvimento de uma linha celular estável contento o sistema RUSH aplicado a IL-7Rα, de modo a realizar estudos de maior duração, em células que expressem os intervenientes das vias em análise a níveis fisiológicos, de modo a melhor compreender a cinética por detrás do transporte de IL-7Rα para a superfície celular e determinar o local exacto no qual o receptor mutante consegue activar a sinalização mediada por ele, no interior da célula. A clarificação dos mecanismos envolvidos na actividade intracelular de IL-7R mutado é de uma enorme importância, devido ao facto de esta capacidade representar uma possível estratégia de evasão a terapias dirigidas a este receptor, que estão a ser desenvolvidas de momento. Para além disso, este trabalho revela uma característica que poderá estar possivelmente presente em outros receptores, envolvidos inclusivamente em outros tipos de cancro e patologias.